家兔组胺H3受体基因克隆及可变剪接鉴定

摘要

RNA的选择性剪接(可变剪接)机制的存在使单个基因具有产生多种蛋白质的能力，是增加真核基因表达多样性的一个非常广泛的机制。愈来愈多的人类疾病被发现与不正常的选择性剪接相关，据估计，至少15﹪～50﹪的人类遗传性疾病是由于基本剪接信号或辅助调控元件发生突变而造成。H3受体mRNA可以发生选择性剪接，自从1999年Lovenberg等人将人类的H3受体cDNA克隆以来，豚鼠、大鼠、小鼠、猴子和仓鼠的H3受体cDNA也相继被克隆和测序，并在人类、豚鼠、大鼠、小鼠和仓鼠中发现H3受体的选择性剪接，但在猴子中未发现，兔子还未见报道。组胺H3受体被发现能够调节组胺、乙酰胆碱、谷氨酸、多巴胺，5-羟色胺(血清紧张素)和去甲肾上腺素等多种神经递质的合成与释放，与觉醒、活动能力、体温调节、摄食、学习与记忆等生理功能有关，人们正在研究以H3受体作为靶点来治疗睡眠障碍、肥胖、哮喘、心脏疾病、偏头痛、癫痫和一些认知缺陷性疾患，如注意力缺陷/多动紊乱、早老性痴呆和精神分裂症等。因此H3受体具有作为靶标开发高效和选择性的新型拮抗类和激动类药物的巨大潜力。家兔作为一种常用的实验动物，有可能被用作H3受体相关疾病的动物模型的建立，对家兔H3受体基因进行克隆并研究其可变剪接可能具有积极意义。 本研究的主要目的是克隆家兔H3受体基因的编码区并对其可变剪接进行检测和鉴定。为了克隆家兔H3受体基因，我们采用了分段克隆不同外显子的策略，通过聚合酶链反应(PCR)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，分别用从家兔的肝脏中提取的DNA和从家兔的大脑皮层提取的总RNA作为模板，使用根据已知动物的H3受体基因设计的保守引物，扩增出了家兔H3受体基因编码区的三个片段，将PCR和RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，然后连接到T载体，克隆到菌株E.coliDH5α，测序得到目的片段的碱基序列。最后将三个片段通过重叠序列拼接成完整的家兔H3受体基因编码序列。然后根据获得的家兔H3受体cDNA序列，在编码家兔H3受体第3细胞内环区域设计引物，通过对可变剪接产物进行RT-PCR，然后将RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，再连接到T载体，克隆到菌株E.coliDH5α，测序得到目的片段的碱基序列。最后通过与家兔H3受体cDNA编码区全长的序列比对，推测出发生可变剪接的位点和剪去片段的长度。 本研究获得的结果表明，家兔H3受体基因编码区全长1338bp,推测编码445个氨基酸残基构成的蛋白质，与已知动物的H3受体推测的长度一致。在家兔大脑皮质中检测到至少三种可变剪接产物，经比对发现其剪接位点与已知动物的均不相同，证明在家兔脑中存在H3受体mRNA新的可变剪接类型。 这些研究成果的取得不但为进一步研究家兔H3受体奠定了基础，而且也为探讨H3受体选择性剪接的机制提出了新的问题，并为H3受体相关疾病的研究打下良好的基础。

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结论

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综述 组胺H3受体的基因、同工型与药物开发

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