缺乏D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶对分枝杆菌生长和细胞形态的影响

摘要

本论文以耻垢分枝杆菌(Atycobacterium smegmatis，Sm)mc<'2>155 菌株作为实验模式菌，用同源重组方法建立mc<'2>155 rmlA基因敲除菌株。通过测定rmlA基因敲除菌株的生长曲线，确定rmlA基因是否为分枝杆菌生长必需基因。在此基础上，研究RmlA酶缺乏时rmlA基因敲除菌株细胞形态的改变，和在缺乏RmlA酶的情况下 rmlA基因敲除菌株蛋白质谱的变化。研究结果将为参与dTDP-鼠李糖合成的D-葡萄糖-1．磷酸胸苷转移酶作为研发抗结核新药的靶标提供更有力的证掘。本文获得以下结果： 1．条件性复制质粒 pPR27-xylE-Sm rmlA∶∶Kan<'R>的构建： 根据 Tb RmlA的氨基酸序列，对TIGR 的耻垢分枝杆菌mc<'2>155菌株基因组数据库进行BLAST分析，获得mc<'2>155的rmlA和启动子(上游约500 bp)序列。从mc<'2>155基因组中PCR扩增该基因及其启动子序列，克隆到pMD18-T 克隆质粒，用BcaBEST Primer M13-47、RV-M对质粒上携带的Sm rmlA基因及其启动子序列进行DNA测序，并与已知的Sm rmlA基因及其启动子序列进行比对，结果表明PCR扩增的是正确的Sm rmlA基因。 用BamHI酶切pUC4K质粒获得Kan抗性基因(Kan<'R>)，用Klenow补平Kan<'K>基因的两端并克隆到pMD18-Sm rmlA 质粒中SmrmlA上的StuI位点，产生Sm rmlA∶∶Kan<'R>突变基因。再将SmrmlA∶∶Kan<'R>突变基因克隆到pPR27-xylE质粒，构建出条件性复制质粒pPR27-xylE-Sm rmlA∶∶Kan<'K>。pPR27-xylE携带温度敏感型复制子，使质粒在允许温度(30℃)条件下可以复制，在非允许温度(42℃)条件下不能复制。pPR27-xylE还携带xylE基因和负选择标记sacB基因。 2．营救质粒pCG76-Tb rmlA的构建： 从结核分枝杆菌H37Rv基因组中PCR扩增Tb rmlA基因，克隆到pMD18-T 克隆质粒，测序与比对结果表明PCR扩增的是正确的TbrmlA基因。用NdeI和XhoI酶切质粒pMD18-Tb rmlA，获得Tb rmlA基因，克隆到pET23b-Phsp60 质粒的相应位点，构建出pET23b-Phsp60-Tb rmlA质粒。再经XhoI酶切、Klenow补平和XbaI酶切获得Phsp60-Tb rmlA片段。其中的Phsp60是来源于分枝杆菌BCG热休克蛋白60的启动子。将Phsp60-Tb rmlA克隆到pCG76质粒，构建出pCG76-Tb rmlA营救质粒。由于pCG76不携带用于目的基因表达的启动子，目的基因Tb rmlA的表达由Phsp60启动子所控制。此外，pCG76质粒也携带温度敏感型复制子，使质粒在30℃条件下可以复制，在42℃条件下不能复制。因此，可以通过调节温度使pCG76-Tb rmlA营救质补偿或不补偿mc<'2>155 Sm rmlA基因敲除菌株中Sm rmlA∶Kan<'K>突变基因的功能。 3．第一次同源重组突变菌株mc<'2>155 M-1 的筛选： 将条件复制性质粒pPR27-xylE-Sm rmlA::Kan<'R>电转化到mc<'2>155感受念细胞中，由于pPR27-xylE-Sm rmlA::Kan<'R>在42°C不能复制，SmrmlA::Kan<'R>与mc<'2>155基因组中的Sm rmlA发生同源重组，使SmrmlA::Kan<'R> 以及sacB基因和xylE基因整合到mc<'2>155基因组中。用Sm rmlA探针对 SmaI酶切的 7个黄色菌落基因组 DNA进行Southern杂交分析，结果显示发生第一次同源重组的mc<'2>155 M-1突变菌株具有预期的杂交条带(3.24 kb，7.72 kb和8.07 kb)。 4.第二次同源重组突变菌株mc<'2> 155 M-2(Sm rmlA基因敲除)的筛选： 将pCG76-Tb rmlA营救质粒电转化到mc<'2>155M-1感受态细胞中，用含10﹪蔗糖的选择性LB琼脂培养基，在30°C培养转化的mc<'2>155M-1，由于条件复制质粒的sacB基因和xylE基因也被整合到mc<'2>155M-1基因组中，sacB基因的表达产物Levansucrase水解蔗糖，产生有害细菌生长的物质，引起mc<'2>155M-1死亡，所以在这种选择压力下，mc<'2>155 M-1基因组中的Sm rmlA::Kan<'R>与Sm rmlA发生第二次同源重组，将Sm rmlA基因、scaB基因以及xylE基因从mc<'2> 155 M-1基因组中删除并被核酸酶水解，基因组中只存在Sm rmlA::Kan<'R>。如果SmrmlA为分枝杆菌生长必需基因，营救质粒上的Tb rmlA基因必须在mc<'2>155 M-2突变菌株中表达出Tb RmlA蛋白质以补偿Sm rmlA::Kan<'R>的功能。用Southern印迹方法筛选出mc<'2>155 M-2突变菌株，即SmrmlA基因敲除菌株。 5.生长曲线的测定测定mc<'2> 155 M-2突变菌株在3°C和42°C的生长曲线，结果发现该突变菌株在30°C可以生长，但在42°C不生长，说明rmlA基因是分枝杆菌生长必需基因。 在随后的温度转换实验中，让mc<'2>155 M-2突变菌株在营救质粒容许的30°C生长20小时，使之表达一定量Tb RmlA蛋白后，提高温度至，42°C，使pCG76-Tb rmlA不能复制，影响Tb RmlA蛋白的表达。在Tb RmlA逐渐缺乏的情况下，测定mc<'2>155 M-2突变菌株的生长曲线。结果显示mc<'2> 155 M-2突变菌株可以在42°C继续增殖1-2天，第三天以后逐渐有细菌死亡，菌量减少。进一步说明了rmlA基因是分枝杆菌生长必需基因。 6.RmlA缺乏对突变菌株mc<'2>155 M-2细胞形态的影响在温度转换实验中，取mc<'2>155 M-2突变菌株细胞用扫描电镜观察其细胞形态。结果显示在30℃条件下，该mc<'2>155 M-2 突变菌株均呈短棒状、轮廓饱满、表面光滑的形念。与野生型对照无明显差异。但在42℃条件下，营救质粒Tb rmlA表达受影响致使RmlA蛋白缺乏时，第三天菌体表面出现明显的塌陷和皱褶，第六天甚至出现大量破碎样物质，菌体轮廓亦不清晰，似乎都粘连在一起，部分细菌发生裂解。说明RmlA蛋白缺乏对细胞壁完整性有影响，可导致细胞裂解。 7．RmlA缺乏对突变菌株mc<'2>155 M-2 蛋白质谱的影响在温度转换以后，收获在42℃生长5天的mc<'2>155 M-2 细菌细胞提取胞浆蛋白，进行双向凝胶电泳，初步发现mc<'2>155 M-2 的蛋白质谱有所变化。与对照相比，rmlA基因敲除以后蛋白质点变少，由于RmlA的缺乏可能导致许多与胞壁代谢有关蛋白的降低，需要进一步确认这些点。 结论： 本研究以耻垢分枝杆菌mc<'2>155菌株作为实验模式菌证明rmlA基因与分枝杆菌生长的相关性。我们构建了携带Sm rmlA∶∶Kan<'R>突变基因的条件复制质粒并转化mc<'2>155，用Southern印记方法筛选出发生第一次同源重组的mc<'2>155 M-1突变菌株。又构建了携带Tb rmlA基因的营救质粒pCG76-Tb rmlA，并转化mc<'2>155 M-1，当Tb rmlA基因表达时，mc<'2>155 M-1基因组中的Sm rmlA∶∶Kan<'R>突变基因与Sm rmlA基因发生第二次同源重组，用Southern印记方法筛选出发生第二次同源重组的mc<'2>155 M-2突变菌株，即Sm rmIA基因敲除菌株。根据Sm rmlA基因敲除菌株在30℃和42℃条件下的生长曲线，以及在缺乏TbRmlA蛋白条件下Sm rmlA基因敲除菌株细胞形态的改变和蛋白质谱的变化，我们证实了编码结核分枝杆菌 D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶(RmlA)的rmlA基因是分枝杆菌生长所必需的基因。缺乏RmlA蛋白使细菌胞壁成分合成受阻，导致细菌裂解死亡。在缺乏RmlA蛋白时，细菌蛋白质谱也发生了改变。我们将进一步对这些蛋白质进行鉴定，以发现更多的药物作用靶点。 本研究结果为参与dTDP-鼠李糖合成的 D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶作为研发抗结核新药的理想靶标提供更有力的证据，以便用D-葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶促反应筛选酶抑制剂，发现先导化合物。 未来研究方向： 1．重复和优化双向电泳条件，并根据双向电泳结果，对感兴趣的蛋白质差异点用胰蛋白酶进行酶解，然后用质谱方法获得肽质谱并与数据库比对，以发现更多的靶点。然后进一步采用分子生物学的方法，克隆这些差异蛋白的基因，鉴定其功能，以期发现rmlA基因与其它基因之间是否存在相互调控相互影响的关系。 2.用高效液相色谱(HPLC)方法分析Sm rmlA基因敲除菌株与野生型mc<'2>155菌株之间细胞壁聚糖(聚阿拉伯半乳糖)结构的差异；用气相色谱(GC)分析二者糖组成的差别； 3.通过RmlA酶活性检测方法的建立，筛选和优化有该酶抑制活性的先导化合物，以期寻找到新型抗结核药物。在此基础上，用本文构建的rmlA基因敲除细胞模型进一步鉴定该化合物。

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摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 全球结核控制现状和抗结核药物作用机制的研究

致谢