结核分枝杆菌1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶抑制剂高通量筛选模型的建立与应用

摘要

目的 建立1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶抑制剂的高通量筛选模型,从不同来源的样品中筛选该酶抑制剂,以期获得作用于该靶点的全新作用机制的抗结核药物先导物.方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,克隆基因dxr构建重组表达质粒pET28a(+)::dxr; IPTG诱导表达并经Ni2+亲和层析柱纯化得到具有天然酶活性的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶;基于该酶促反应底物NADPH在340nm波长下具有光吸收的原理,建立和优化酶活测定体系,构建并评价酶抑制剂的高通量筛选模型;应用此模型进行酶抑制剂筛选并进行抑酶活性及抗菌活性评价.结果 成功得到具有天然酶活性的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶,构建了1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶抑制剂的高通量筛选模型并得到3个抑酶活性较高的阳性化合物,其中化合物IMB-DXR-B1为该酶的反竞争性抑制剂,其K值为6.2μmol/L,IC50为29.5μmol/L,该化合物对于结核分枝杆菌H37Rv的MIC为32μg/mL.结论 成功构建了稳定性好、灵敏度高的结核分枝杆菌1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶抑制剂的高通量筛选模型,筛选得到具有抗结核活性的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶抑制剂,为获得全新作用靶点的新型抗结核药物奠定了基础.