维甲酸诱导腭裂形成时空变化中细胞增殖与凋亡的作用研究

摘要

背景：腭裂是一种常见的先天性畸形，因其影响因素十分复杂，发生机制目前仍未明确。胚胎时期细胞增殖、分化形成组织器官的原基，在其过程中也存在细胞凋亡现象，是组织进行自我更新、决定新生细胞数量及速度的重要因素。腭的发育中常由于各种因素影响腭突的正常发育过程，导致腭发育畸形。近年来一些研究表明，腭中嵴上皮(MEE)细胞和腭胚间充质(EPM)细胞的增殖和凋亡对腭的正常发育具有重要作用，与腭裂的形成密切相关。在已知能诱发腭裂的致畸物质中，维甲酸(retinoic acid，RA)是致畸作用比较显著的一种，有文献表明在胚胎畸形发生中，RA可能具有抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用。腭突生长的不同时期摄入RA所诱导的腭裂形式不同，但其机制尚不明确。BrdU能特异标识S期细胞，是反映细胞增殖及跟踪监测增殖细胞的理想指标。TUNEL是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征。 本实验应用稳定的腭裂畸形的动物模型体系，分别在腭突发生的不同时期给与小鼠RA，用BrdU标识腭突增殖细胞，TUNEL标识凋亡细胞，通过研究MEE细胞和EPM细胞在腭突融合期的增殖和凋亡的改变，来探索RA作用于腭突发生的不同时期所诱导的腭裂的发生机制。 目的：本实验通过研究MEE细胞和EPM细胞在腭突融合期增殖和凋亡的改变，来探索RA作用于腭突发生的不同时期所诱导的腭裂的发生机制。 方法：选取10周龄左右SPF级C57BL/6J．近交系小鼠，于第一天晚8时按雌雄比2:1合笼交配。第二天上午8时检测阴栓，将阴栓阳性的雌鼠记为妊娠0天(gestation day 0，GDO)，共得到孕鼠32只，将这些孕鼠随机分为三组：第一组为对照组，共8只；第二组为10天给药组，共16只；第三组为12天给药组共8只。10天给药组和12天给药组的孕鼠分别在GD10上午10时、GD12上午10时按100mg/kg体重灌胃RA；对照组灌胃植物油0.2m1。全部孕鼠于GD15上午10时处死，处死前20分钟均按100mg/kg体重腹腔注射BrdU。BrdU和TUNEL免疫组化染色方法标识腭突融合期即小鼠胚胎15天(Embryonic day 15，E15)实验组和对照组腭突中增殖和凋亡细胞的表达和分布变化，然后用标识指数(BI和TI)分析。 结果：1、在腭突融合期即E15，10天给药组小鼠EPM细胞中BrdU阳性细胞率在冠状面和水平面切片都明显低于对照组(P<0.01)；12天给药组和对照组小鼠EPM细胞中BrdU阳性细胞率在冠状面和水平面无显著性差异(P>0.05)；2、10天给药组小鼠MEE细胞中BrdU阳性细胞率在水平面明显低于对照组(P<0.05)；12天给药组与对照组小鼠MEE细胞中BrdU阳性细胞率无显著性差异(P>0.05)；3、12天给药组与对照组小鼠EPM细胞中未见TUNEL阳性细胞，10天给药组小鼠EPM细胞中TUNEL阳性细胞呈散在分布(P<0.01)；对照组与12天给药组小鼠EPM细胞中TUNEL阳性细胞率无显著性差异(P>0.05)；4、10天给药组小鼠MEE细胞中TUNEL阳性细胞率明显低于对照组(P<0.01)；12天给药组与对照组小鼠MEE细胞中TUNEL阳性细胞率无显著性差异(P>0.0 5)。 结论：1、RA作用于腭突发生不同时期诱导的腭裂形式不同：作用于腭突发生前期，双侧腭突形态发育障碍、接触失败导致腭裂；作用于腭突垂直生长期，双侧腭突形态发育正常，发生接触但融合失败。2、RA作用于腭突发生前期，诱导EPM细胞增殖抑制、凋亡过度，最终导致双侧腭突形态发育障碍、接触失败，是腭裂产生的原因之一。3、腭突融合期，凋亡不是MEE细胞唯一的转归形式，RA作用于腭突垂直生长期可能影响了MEE细胞除凋亡以外的其它转归形式。

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摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 细胞凋亡及相关因子在腭裂畸形发生中的作用

致谢

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