人乳腺癌组织中D2-40标记的微淋巴管密度与VEGF-A、VEGF-C表达关系的研究

摘要

研究背景及目的：乳腺癌是一个复杂的全身性恶性疾病，研究表明乳腺癌组织生长超过0.2cm～0.3cm大小时，在许多正负调控因子的相互作用下就开始了新生脉管的形成，供应肿瘤生长所必需的氧气和营养物质。但是至今乳腺癌诱导淋巴管生成的分子机制以及新生淋巴管与乳腺癌淋巴道转移问的确切关系尚不甚明确。研究表明血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factorA，VEGF-A)是目前已知的对血管生成起直接作用的重要因子之一，能刺激血管内皮细胞增生和迁移，而血管内皮生长因子C(Vascular endothelial growth factor C，’VEGF-C)可能和肿瘤淋巴管生成有关，有望成为体内重要的促淋巴管生成因子。新生的毛细血管与毛细淋巴管在许多方面极其相似，以往对肿瘤淋巴管生成的研究因为缺乏淋巴管内皮细胞特异性标记物，仅依靠普通的HE染色技术很难将它们在形态学上与毛细血管截然区分，因此对肿瘤新生淋巴管生成的研究远远滞后于对肿瘤新生血管生成的研究。近年来，虽然血管内皮生长因子受体3(Vascular endothelialgrowth factor receptor3，VEGFR-3)、淋巴管内皮透明质酸受体(Lymphatic vesselcell edothelial hyaluronan receptor，LYVE-1)等一些淋巴管内皮细胞标记物陆续被发现，但最近多项研究证实这些常用标记物不仅在淋巴管内皮细胞中表达，而且在血管内皮细胞中也有表达，影响了在形态学上对肿瘤微淋巴管和肿瘤微血管的区分。1999年Marks等发现的D2-40分子是一种可以和胚胎睾丸细胞膜及干细胞膜表面的癌胚抗原M2A(一种分子量为40KD的O链-唾液酸糖蛋白)发生特异性免疫反应的单克隆抗体。2006年最新的研究发现D2-40在淋巴管内皮细胞上有固定的抗原决定簇，可以用来标识恶性黑色素瘤、前列腺癌、胃癌、肾细胞癌等多种肿瘤的新生微淋巴管，在有管壁平滑肌的成熟淋巴管和微血管内皮上没有表达，因此其有望成为一种新的淋巴管内皮特异性标记物。但应用D2-40单抗标记乳腺癌组织中微淋巴管的研究却罕见报道。 本研究旨在对比CD31标记的微血管，观察乳腺癌组织中D2-40标记的微淋巴管的形态及分布特征，通过半定量方法分析VEGF-C、VEGF-A在mKNA转录和蛋白翻译水平上的表达情况及其与乳腺癌腋淋巴结转移、临床分期、P53和C-erbB-2等与乳腺癌预后相关的临床病理学因素之间的相关性，并进一步探讨D2-40标记的微淋巴管密度与VEGF-A、VEGF-C的表达及乳腺癌腋淋巴结转移的关系，为继续研究乳腺癌转移的分子机制和寻找更新的与乳腺癌患者生存有关的预后因子提供了理论基础和实验依据。实验方法：收集沈阳军区总医院2003年1月～2006年10月存档的乳腺癌术后组织石蜡标本102例和乳腺纤维腺瘤标本25例。应用免疫组化SP法及原位杂交方法检测VEGF-A、VEGF-C的蛋白质表达水平及VEGF-C mRNA的丰度，采用半定量方法进行染色结果判断及分析；应用单标免疫组化SP法及双标免疫组化法(蓝紫色的BCIP/NBT显色系统和鲜红色的AEC显色系统)检测D2-40和CD31标记的肿瘤新生脉管的的表达情况，并在显微镜下计数D2-40阳性微淋巴管密度(Lymphaticmicrovessels density，LMVD)。采用SPSS14.0统计分析软件进行t检验、x<'2>检验、方差分析等统计分析。 实验结果：102例人乳腺癌组织中D2-40仅标记于CD31阴性且管壁薄、形态不规则、管腔大小不一的微淋巴管上，在富含肌层的成熟淋巴管和微血管上不表达。本组D2-40反应阳性率为76.5﹪(78/102)，中位LMVD为21.6(19.72±5.11)个微淋巴管/100倍视野，且瘤周组织LMVD显著高于瘤内(p=0.000)。按照乳腺癌腋淋巴结转移数目分层分析，腋淋巴结转移数目和瘤周区域组织D2-40标记微淋巴管密度相关(P<0.05)，腋淋巴结转移数目越多，D2-40阳性的微淋巴管密度越大，而和瘤内区域D2-40标记的微淋巴管密度无统计学相关性(p>0.05)。 免疫组化方法半定量检测发现VEGF-A、VEGF-C蛋白主要表达于乳腺癌细胞的胞浆或胞膜及少量间质脉管内皮细胞胞浆，阳性率分别为64.7﹪(66/102)和55.9﹪(57/102)，显著高于对照组(P<0.05)。VEGF-C mRNA的表达主要位于乳腺癌细胞的胞浆中，阳性率为59.8﹪(61/102)，与其蛋白翻译水平基本一致。VEGF-A在蛋白质翻译水平上的表达强度与乳腺癌大小、腋淋巴结转移数目和临床分期有关(P<0.05)，而与患者年龄、组织学分级无明显相关(P>0.05)：VEGF-C在mRNA转录丰度和蛋白质翻译水平上的表达强度均与乳腺癌乳腺癌大小、腋淋巴结转移及临床分期有明显相关性(P<0.05)。在乳腺癌组织中VEGF-A、VEGF-C的免疫组化表达强度及VEGF-CmRNA转录丰度与C-erbB-2、P53的表达强度相关(P<0.05)。 VEGF-C在蛋白及mRNA水平上的表达均与D2-40标记淋巴管密度有显著相关性(P<0.05)，随着VEGF-CmRNA转录丰度和VEGF-C蛋白质表达丰度的增高，阳性淋巴管密度也逐渐增加，肿瘤周围管腔扩张的功能型微淋巴管密度增加更明显(P<0.05)。VEGF-A阳性组也可见D2-40标记阳性微淋巴管表达，但淋巴管数目较少，尚不能进行统计学分析。结论：在人乳腺癌中，新近发现的单克隆抗体D2-40标记的瘤周微淋巴管密度与乳腺癌腋淋巴结转移数目相关(P<0.05)，其有望成为人乳腺癌组织微淋巴管内皮细胞的特异性标记物。对血管内皮细胞生长因子的半定量分析发现人乳腺癌中VEGF-C的mRNA转录丰度与其蛋白质翻译水平相大致相同(59.8﹪和55.9﹪)，且统计学分析显示VEGF-A蛋白表达率、VEGF-C蛋白表达率及mRNA转录丰度与乳腺癌肿块大小、腋淋巴结转移情况、临床分期等与乳腺癌预后相关的临床病理因素有统计学相关性(P<0.05)，这表明VEGF家族可能参与了肿瘤的扩散转移，并有望成为一个判断乳腺癌预后的生物学指标。对比C-erbB-2、P53与VEGF-A蛋白、VEGF-C蛋白及VEGF-CmRNA的表达情况，发现癌基因C-erbB-2和抑癌基因P53可能通过上调VEGF-A和VEGF-C的表达参与乳腺癌的不断扩散与转移。本研究还发现VEGF-C在mRNA转录水平和蛋白质翻译水平上的高表达与乳腺癌瘤周微淋巴管密度相关，其可能参与了乳腺癌微淋巴管的生成和乳腺癌淋巴转移，这为进一步研究乳腺癌的预后和淋巴转移的分子机制提供了形态学依据。

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综述 VEGF及其受体与肿瘤发生和转移的关系的研究进展

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