银杏叶提取物对酒精所致大鼠骨骼肌氧化凋亡损伤的保护及治疗作用的研究

摘要

慢性酒精中毒性肌病(Chronic alcoholic myopathy，CAM)是由于长期酗酒引起的一种肌肉病，在嗜酒者中发病率约40％—60％，临床主要表现为肌无力、肌痛和肌萎缩，严重影响患者的生活质量。有资料表明长期酗酒能够引起骨骼肌氧化．抗氧化平衡失调以及骨骼肌细胞的过度凋亡。银杏叶标准提取物(extract of Ginkgo biloba，EGb761)是从银杏叶中提取的混合物(6％萜内酯、24％黄酮苷)，研究表明其具有抗氧化及抗凋亡作用。目前国内外用银杏叶提取物作为清除自由基和抗脂质过氧化的药物来治疗心脑血管疾病等方面的报道很多，而在慢性酒精中毒性肌病中尚未见报道。在CAM患者日益增加的今天，对于该病发病机制及防治用药的研究具有重要的社会意义。本实验拟讨论酒精导致的氧化损伤对骨骼肌凋亡的影响及其相关机制，并以此为切入点研究银杏叶提取物防治CAM的作用机制，为其临床应用提供理论及实验依据。 目的： 本实验从体内及体外实验两个方面进行研究。体内实验拟在建立大鼠慢性酒精中毒性肌病模型的基础上，同时采用EGb761预防及治疗，以Ⅱ型肌纤维为主的跖肌为研究对象观察大鼠骨骼肌组织氧化-抗氧化指标，骨骼肌细胞的凋亡率，凋亡相关基因的变化以及肌肉组织病理学的改变，探讨EGb761的保护及治疗作用及其可能的作用机制。体外实验拟在建立骨骼肌原代细胞培养的基础上，给予无水乙醇及EGb761干预，观察乙醇浓度及作用时间与骨骼肌细胞凋亡改变的关系，同时观察EGb761对乙醇造成的骨骼肌细胞凋亡损伤的保护作用。 方法： 体内实验： (1)选健康SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠70只随机分成四组(对照组，酒精组，治疗组，预防配合治疗组)，在建立慢性酒精中毒性大鼠肌病模型的基础上给予Egb761进行预防(96μg/g bw per day)及治疗(192μg/g bw per day)，四组均喂饲改良的全营养高脂饲料，观察实验前后各组大鼠体重、行为学变化及肌肉组织病理学改变。 (2)于12周后，取后肢跖肌肌肉，制备成冰冻切片，经组织化学染色确认成模。 (3)采用AnnexinV/PI双重染色法检测各组大鼠跖肌的细胞凋亡率；采用免疫组织化学SABC法检测凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达；采用RT-PCR的方法检测各组大鼠跖肌中Bcl-2和Bax mRNA的表达：分光光度计法检测各组跖肌丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和诱导性一氧化氮合酶(iNOS)活性的变化。 体外实验： (1)选健康SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠进行骨骼肌原代细胞培养，并使用Desmin抗体采用免疫组化方法进行骨骼肌细胞鉴定。 (2)以骨骼肌细胞作为研究对象，采用台盼蓝(Trypan blue)染色法检测乙醇对骨骼肌细胞增殖的影响：Annexin V/PI双重染色法及Hoechst33258荧光染色检测对细胞凋亡的影响。(3)在乙醇作用的基础上，采用噻唑蓝(MTT)法检测EGb761对骨骼肌细胞增殖的影响，Annexin V/PI双重染色法检测EGb761对细胞凋亡的影响。 结果： 体内实验： (1)实验前后大鼠体重变化显示酒精组大鼠的体重随着酒精的摄入逐渐下降，到12周时明显低于对照组；EGb761干预后大鼠体重较酒精组有所升高。 (2)肌肉形态学观察显示酒精组大鼠骨骼肌纤维出现了肌纤维变性、坏死，肌纤维萎缩呈角形、条形或不规则形改变，肌间结缔组织增生等病理改变。而与酒精组相比，EGb761明显改善大鼠肌肉病变程度。 (3)Annexin V/PI双重染色法结果显示酒精组的细胞凋亡率较对照组明显升高，而EGb761干预后，细胞凋亡率较酒精组明显下降。 (4)免疫组织化学结果显示酒精组与对照组相比Bax和Bcl-2蛋白表达差异显著，明显增加，Bcl-2/Bax的比值下降；EGb761干预组与酒精组相比Bax蛋白表达显著减少，Bel-2蛋白表达显著增加，Bcl-2/Bax的比值亦升高。 (5)RT-PCR结果显示酒精组Bax和Bcl-2的mRNA表达水平较对照组明显增高；EGb761干预后，Bax表达较酒精组明显下降，而Bcl-2明显升高。 (6)生化指标检测结果：酒精组MDA含量较对照组明显升高，SOD、GSH-Px活性明显下降，iNOS活性明显升高；EGb761干预后，MDA含量较酒精组明显下降，而SOD、GSH-Px活性明显升高，iNOS活性明显降低。 体外实验： (1)Desmin抗体免疫组化结果显示90％以上为骨骼肌细胞。 (2)台盼蓝(Trypan blue)染色法结果显示细胞生存率随着乙醇浓度的增加逐渐降低，而细胞死亡率随着乙醇作用时间的增加而逐渐升高。 (3)Annexin V/PI双重染色法及Hoechst33258荧光染色结果显示，乙醇作用后骨骼肌细胞凋亡率呈时间及剂量相关性增加。 (4)MTT法结果显示EGb761作用后，乙醇作用后的骨骼肌细胞生存率随着EGb761浓度的增加而升高。Annexin V/PI双重染色法结果显示EGb761可降低乙醇诱导的骨骼肌细胞凋亡。 结论： (1)长期酒精摄入可造成骨骼肌细胞凋亡，推测与氧化．抗氧化失衡，iNOS增多及改变凋亡相关基因Bax和Bc1-2的表达有关。 (2)EGb761可降低CAM骨骼肌细胞凋亡率，推测与抑制氧自由基的生成，降低iNOS活性，下调促凋亡基因Bax，上调抑凋亡基因Bc1-2的表达有关。 (3)EGb761对慢性酒精中毒性肌病不仅有一定的治疗作用，而且还有一定的预防作用。

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综述细胞凋亡与慢性酒精中毒性肌病

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