源于一种纤维单胞菌的聚阿拉伯糖内切酶的分离纯化及部分性质的鉴定

摘要

目的：分离纯化一种由纤维单胞菌属(Cellulomonose sp．)的细菌发酵产生的具有聚阿拉伯糖内切酶的性质的蛋白酶(暂命名为聚阿拉伯糖内切酶)并对其进行性质鉴定。本课题选取能将聚阿拉伯半乳糖(Arabinogalactan,AG)水解成六聚阿拉伯糖片段的内切酶作为研究对象。这种水解酶存在于一种细菌(该细菌尚无确切的名称，但它的生物性质与纤维单胞菌相似)的外分泌液中。鉴于目前还没有聚阿拉伯糖内切酶基因序列的相关报道，所以分离纯化成为获取目标蛋白质的有效途径。AG是分枝杆菌细胞壁的重要组成部分，是由聚阿拉伯糖和聚半乳糖组成的具有复杂分支结构的大分子聚糖。由于AG在结构上具有特殊性，所以常被作为抗结核药物作用的靶点。正因为如此，有关AG的结构研究一直都没有中断过。其中，寻找有效的手段水解AG是一个重要的研究方面。使用传统的化学分析方法常常在降解AG的过程中改变个别糖基的结构，无法获得原始的结构信息，而改用酶水解则可以有效的解决这一问题。使用专一的内切酶将AG大分子降解成合适的片段，再用质谱和核磁共振方法确定这些小片段的分子结构，并将得到的结构信息进行组合，最终就可以得出AG的完整结构。而施行此方法的前提条件是得到合适的聚糖内切酶。本课题拟分离出一种六聚阿拉伯糖内切酶，并将它作为一种新型的工具酶，用于结核分枝杆菌细胞壁的结构分析；而对该酶的性质的鉴定，则可以作为进一步研究同类水解酶的依据。 方法：使用多种不同的层析方法从纤维单胞菌属的细菌发酵液中纯化聚阿拉伯糖内切酶，并对其进行性质鉴定。具体方法归纳如下：1)建立稳定可信的酶活性测定方法。利用薄板层析(TLC)实现反应底物与产物的有效分离，并利用该方法来检测聚阿拉伯糖内切酶的活性，结合Quanti-Scan软件进行定量分析。2)以纤维单胞菌属细菌的发酵液为原料，通过DEAE-Sepharose离子交换层析，Sephacryl S-300分子筛和Blue-Dye活性染料亲和层析三种手段串联，逐步纯化聚阿拉伯糖内切酶，在纯化过程中，用上述酶活性测定方法追踪酶活性。3)纯化后的样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，测定其纯度及相对分子质量，用TLC法与Quanti-Scan软件结合测定酶活力，测定反应最适温度和最适pH，用Lineweare-Burk双倒数做图法测定酶促反应动力学特性。 结果：1)本文利用TLC实现了大分子底物AG与底物被水解释放的小分子寡聚阿拉伯糖产物的分离，生成产物的量可以经Ouanti-Scan软件扫描定量。该方法的关键在于展层剂的选择。为了达到最佳的分离效果，我们根据不同糖片段的极性差异来选择展层剂。分别选取乙醇，异戊醇，正丁醇和乙酸作为展层剂，并将其按不同比例混合。根据实验结果，最终确定正丁醇：乙酸(1：1)作为展层剂。该方法具有快速、稳定、准确和可以定量的特点，而且可同时检测多个样品。这些特点使该方法适合在聚阿拉伯糖内切酶纯化时进行酶活性的监测。2)在细菌发酵液中，目标蛋白的含量极低，并且残留了粘度很高的发酵原料(结核杆菌细胞壁的成分)，这些因素使得后续的纯化步骤更加困难。由于对该酶的理化性质一无所知，所以，我们尝试了多种纯化方法，并从中筛选了几种有效的柱层析。其中，DEAE-Sepharose弱阴离子交换层析，不仅可以在短时间内处理大量的样品，而且可以除去杂蛋白，并在一定程度上浓缩目的蛋白，因此适合作为纯化的第一步骤。Sephacryl S-300柱层析是按照蛋白质分子量大小的不同来进行分离的，经过这一步纯化，酶蛋白纯度和比活性均得到了提高，同时也去除了发酵液中高粘度的杂质。Blue-Dye是非特异性的亲和层析柱，它可以使目的蛋白的纯度和比活性得到极大的提高。联合使用这些高效的柱层析方法得到了单一的蛋白条带，并具有聚阿拉伯糖内切酶的活性。3)对纯化后的样品进行性质鉴定：该酶的相对分子质量为45 kD，酶促反应动力学符合Michaelis-Menten动力学规律，在40℃反应条件下，米氏常数Km为2.5mg/ml，最大反应速率Vmax为0.083μmol/L.min，最适pH为8.0，pH 6.0-9.0时较稳定。最适温度为40℃，在40℃以下较稳定，超过50℃时酶活力开始下降。蛋白酶比活性为15.42×103(U/ug)，纯化倍数为77.1。 结论；本课题建立的聚阿拉伯糖内切酶的活性检测方法具有快速、稳定、准确及可定量的特点。虽然通过HPLC，可以对糖分子进行定性和定量分析，但是用这种方法来监测在纯化过程中的酶活性过于繁琐。所以，使用TLC与Qnanti-Scan相结合的酶活性测定方法，它更适用于在酶纯化过程中追踪酶活性。通过对聚阿拉伯糖内切酶的纯化，发现该酶在发酵液中的含量极低，由于发酵原料——AG很难获取，所以无法大量制备高浓度的粗酶，这对纯化是一个挑战。针对这一问题，在纯化操作，蛋白含量测定和酶活性测定方法上都进行了有效的尝试和改进，这为今后分离低含量的蛋白酶积累了经验。本课题分离纯化了一种聚阿拉伯糖内切酶，并鉴定了它的部分性质。该酶是一种阿拉伯糖内切酶，能水解AG产生六聚阿拉伯糖。水解产物是AG末端的一个重要结构，这个结构与分枝杆菌的生理特点及致病机理密切相关，可以作为抗结核药物的作用靶点。综上所述，聚阿拉伯糖内切酶不仅是一种新型的工具酶，同时也为研究其他AG水解酶提供了比对依据，可以进一步应用于结核分枝杆菌细胞壁的结构分析及寻找抗结核药物作用的靶点。

目录

声明

摘要

导言

第一章聚阿拉伯糖内切酶活性测定方法的建立

第二章不同分离纯化手段的比较和选择

第三章对聚阿拉伯糖内切酶的组合纯化

第四章对聚阿拉伯糖内切酶部分性质的鉴定

综述：抗结核药物作用靶点的研究进展

致谢