化疗治愈肿瘤动物模型的建立及小剂量CTX抗肿瘤作用机制的研究

摘要

目的： 为深入研究化疗治愈肿瘤的作用机制，本研究利用荷膀胱癌小鼠模型，建立单一剂量化疗药物治愈荷瘤小鼠的动物模型。在此基础上，检测在单一剂量化疗药物治愈肿瘤过程中荷瘤小鼠外周血象的动态变化，分析外周血象的变化与荷瘤小鼠化疗疗效之间的关系，了解血小板包括外周血血小板计数和血浆血小板激活因子水平在化疗治愈肿瘤中的变化及其意义。利用该化疗治愈荷瘤小鼠的动物模型，进一步通过透射电镜观察化疗药物体内治疗72小时后荷瘤小鼠肿瘤组织细胞的形态学变化，明确该化疗药物对肿瘤细胞及肿瘤间质细胞(特别是肿瘤血管内皮细胞)的作用机制；并且分析药物体内治疗72 h内，荷瘤小鼠肿瘤组织内过氧化脂质降解产物丙二醛含量的变化，明确肿瘤组织内肿瘤细胞的损伤或死亡与肿瘤局部脂质过氧化损伤的关系；同时，检测药物体内治疗72h内，荷瘤小鼠血浆内毒素含量和一氧化氮含量的变化，为进一步明确小剂量化疗治愈肿瘤的作用机制奠定基础。 方法： 给正常T739小鼠皮下接种小鼠可移植性膀胱移行细胞癌组织，建立荷膀胱癌小鼠模型。取肿瘤接种后第7天的荷瘤小鼠，称重后随机分两组：治疗组和对照组。治疗组小鼠单次腹腔内注射不同剂量的化疗药物，包括环磷酰胺；对照组小鼠单次腹腔内注射等量生理盐水。用药后每1～3天观察一次各组荷瘤小鼠，并记录小鼠的体重和肿瘤结节的直径。当肿瘤直径接近或等于15mm，视为治疗无效、并将小鼠处死。存活小鼠的肿瘤结节应小于15mm或无瘤。找出能使T739荷瘤小鼠肿瘤消退所需化疗药物的最小使用剂量。如果治疗后荷瘤小鼠肿瘤结节渐缩小甚至消失，继续观察至少60天。肿瘤治愈的标准为：用单一剂量化疗药物治疗后，荷瘤小鼠肿瘤消退，并在随后的2个月内无复发。 然后，再取12只肿瘤接种后第7天的荷瘤小鼠，随机分成两组，治疗组小鼠腹腔内注射能使荷瘤小鼠肿瘤消退所需最小剂量的化疗药物，对照组小鼠腹腔内注射等量生理盐水。分别在用药后6 h、用药后第2、4、9、14 d内眦静脉取血，肝素抗凝后立即进行血常规检测，比较两组荷瘤小鼠外周血红细胞数、血红蛋白浓度、白细胞数和血小板参数的动态变化，分析荷瘤小鼠外周血象的变化与化疗疗效的相互关系。同时，建立液相色谱一串联质谱测定小鼠血浆PAF的方法，检测单剂量化疗药物用药后6 h血浆PAF水平的变化。 最后，再取18只肿瘤接种后第7天的荷瘤小鼠，随机分组，治疗组小鼠腹腔内注射能使荷瘤小鼠肿瘤消退所需最小剂量的化疗药物，对照组小鼠腹腔内注射等量生理盐水。CTX用药后6、24、48、72h荷瘤小鼠内眦静脉取血，肝素抗凝后取血浆。应用BET-16细菌内毒素测定仪，采用动态浊度鲎试剂法检测荷瘤小鼠血浆内毒素水平；采用硝酸还原酶法测定荷瘤小鼠血浆NO浓度。随后将小鼠处死，肿瘤组织制成10％肿瘤组织匀浆，硫代巴比妥酸法检测肿瘤组织中MDA的含量。CTX用药后72h，荷瘤小鼠处死后快速取肿瘤组织切成1.5mm×2 mm大小，4％戊二醛固定后透射电镜观察肿瘤组织细胞的形态学变化。 结果： 1．小剂量CTX治愈荷瘤T739小鼠动物模型的建立接种2mm3的小鼠膀胱癌肿瘤组织可使T739小鼠皮下肿瘤结节进行性生长。接种后第7天肿瘤结节直径约为2～4mm。取肿瘤接种后第7天的荷瘤小鼠，1～16mg/kg的MMC或15～400 mg/kg的CTX单次腹腔内注射。结果发现：(1)不同剂量的MMC用药后1w，随MMC使用剂量的增加荷瘤小鼠化疗的毒副作用加大、肿瘤结节缩小的程度增加；MMC用药后2月，8～16 mg/Kg MMC治疗组和对照组荷瘤小鼠全部死亡，4 mg/kg和1 mg/kg MMC治疗组各有25％的荷瘤小鼠存活。 (2)不同剂量的CTX用药后2w，随CTX用药剂量的增加荷瘤小鼠化疗的毒副作用加大、肿瘤结节缩小的程度增加：CTX用药后2月，100～200 mg/kg CTX治疗组和对照组的荷瘤小鼠全部死亡，40 mg/kg CTX治疗后20％的荷瘤小鼠存活，15 mg/kg CTX治疗组60％的荷瘤小鼠存活，其与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。结果提示：15 mg/kg CTX是可治愈多数荷瘤T739小鼠所需CTX的最小有效剂量。 2．外周血象和血小板激活因子在单剂量CTX治愈荷瘤小鼠过程中的变化及其意义15 mg/kg CTX对荷瘤小鼠外周血象无明显抑制作用。具体表现在：15 mg/kg CTX单次腹腔内注射后6h，荷瘤小鼠外周血RBC计数、血红蛋白度和WBC计数分别为(9.86±0.64)×1012/L、166.6±15.2 g/L和(12.38±3.96)×109/L，与对照组荷瘤小鼠(9.0±0.6)×1012/L、148±10g/L和(10.54±1.74)×109/L比较，差异无统计学意义(P>0.05)；CTX治疗后6 h荷瘤小鼠外周血血小板计数(platelet count，PLT count)为(1483.4±184.4)×109/L，与对照组(1086.6±81.0)×109/L比较，差异具有统计学意义(P<0.01)；而血小板平均容积(mean platelet volume，MPV)、血小板分布宽度(platelet volume distribution width，PDW)和大血小板比率(platelet-large-cell ratio，P-LCR)与治疗组荷瘤小鼠比较差异无统计学意义(P>0.05)。用药后第2、4、9、14天治疗组荷瘤小鼠外周血RBC、WBC计数和PLT参数的变化与对照组小鼠比较差异无统计学意义(P>0.05)。进一步通过建立液相色谱—串联质谱测定小鼠血浆PAF的方法，检测了15mg/kg CTX用药后6h荷瘤小鼠血浆PAF水平的变化，结果发现：CTX治疗组荷瘤小鼠血浆PAF质量浓度为113.98±14.38 ng/ml，而对照组荷瘤小鼠血浆PAF质量浓度为58.34±13.89ng/ml，两组数据比较差异具有统计学意义(P<0.01)。由此可以看出：在小剂量CTX用药后6h，伴随荷瘤小鼠血小板计数的增加血浆PAF水平也明显提高，提示血小板在小剂量CTX治愈肿瘤过程中发挥重要作用。 3．小剂量CTX抗肿瘤作用机制的研究小剂量CTX治疗后72h，透射电镜下荷瘤小鼠肿瘤组织中肿瘤细胞以“凋亡”改变为主，具体表现在：肿瘤细胞体积变小，胞膜起泡或出“芽”，细胞表面突起减少、微绒毛减少甚至消失，相邻细胞间的细胞连接消失，染色质团块状散布核内并边集于核膜下，细胞核固缩呈不均一的块状结构，胞质内可见脂肪堆积，空泡变性等凋亡的特征性交化。同时，肿瘤组织中血管内皮细胞也出现典型的凋亡形态学变化，并伴随肿瘤毛细血管管腔的缩小。此外，肿瘤组织中还见部分肿瘤细胞细胞膜的完整性破坏，出现细胞坏死的形态学变化。电镜结果表明：小剂量CTX治疗后72h，荷瘤小鼠肿瘤组织r中肿瘤细胞凋亡和肿瘤细胞坏死同时存在；同时，肿瘤血管内皮细胞也出现典型的凋亡改变。通过检测荷瘤小鼠肿瘤组织匀浆中脂质过氧化产物MDA的含量，结果发现：小剂量CTX用药后6h，荷瘤小鼠肿瘤组织匀浆中MDA的浓度为14.69±3.86nmol/mgprot，与对照组荷瘤小鼠16.1±1.35 nmol/mgprot比较差异无统计学意义(p>0.05)，CTX用药后24、48、72h荷瘤小鼠肿瘤组织匀浆中MDA浓度较对照组明显降低，分别为8.87±2.70、5.15±2.13和8.92±2.94 nmol/mgprot，提示小剂量CTX治疗后72h内，荷瘤小鼠肿瘤组织内过氧化脂质降解产物MDA的含量无明显升高，说明肿瘤细胞的损伤或死亡与肿瘤局部的脂质过氧化反应无关。通过检测15 mg/kg CTX用药后荷瘤小鼠血浆NO含量，结果发现：CTX用药后6h，荷瘤小鼠血浆NO含量为60.93±5.59μmol/ml，略高于对照组小鼠34.88±19.08 μmol/ml，CTX用药后72h，血浆NO含量升至81.86±17.33 μmol/ml，与对照组荷瘤小鼠比较差异具有统计学意义(p<0.01)。提示小剂量CTX用药后6～72h血浆NO含量逐渐升高，说明血浆NO在小剂量CTX治愈肿瘤过程中发挥重要作用。最后我们检测了小剂量CTX用药后6h荷瘤小鼠血浆内毒素含量，结果发现CTX治疗组荷瘤小鼠血浆内毒素含量为0.29±0.38 Eu/ml，明显低于对照组荷瘤小鼠1.20±0.72 Eu/ml(p<0.05)，提示15 mg/kg CTX用药后6h荷瘤小鼠未出现内毒素血症。 结论： 1.15 mg/kg CTX单次腹腔内注射可治愈多数荷膀胱癌T739小鼠，提示单一剂量CTX治愈荷瘤T739小鼠模型成功建立。 2．15mg/kg CTX单次腹腔内注射在治愈多数荷瘤小鼠的同时对荷瘤小鼠的外周血象无明显抑制作用。CTX用药后6 h，荷瘤小鼠外周血血小板计数和血浆PAF水平明显高于对照组，提示血小板可能在化疗治愈肿瘤发挥重要作用。 3．小剂量CTX体内治疗可诱导荷瘤小鼠肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞的凋亡，而肿瘤细胞的坏死可能与肿瘤血管内皮细胞的损伤有关。小剂量CTX用药后72h内，荷瘤小鼠肿瘤组织内MDA含量的逐渐下降，提示肿瘤细胞的死亡与氧化应激损伤无关。小剂量CTX用药后6 h，荷瘤小鼠体内未出现内毒素血症，CTX用药后72h内血浆NO含量的持续增高与可能CTX用药后血浆PAF水平的升高和肿瘤血管内皮细胞的损伤有关。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

序言

第一部分 单剂量化疗药物治愈荷瘤小鼠动物模型的建立

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 PLT在小剂量CTX治愈肿瘤过程中的变化及其意义

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 小剂量CTX抗肿瘤作用机制的探讨

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 化疗药物抗肿瘤作用机制的研究进展

致谢

作者简介、博士期间科研及获奖情况