辛伐他汀对骨折血肿细胞增殖和成骨分化的影响

摘要

目的:1.分离、培养和鉴定入骨折血肿细胞(human fracture haematoma cells,hFHCs);
　　 2.评价不同浓度辛伐他汀(Simvastatin)对体外培养骨折血肿细胞增殖和成骨分化潜能的影响;
　　 3.探讨辛伐他汀通过影响骨折血肿细胞增殖和成骨分化进而影响骨折愈合的可能机制。
　　 方法:1.取材:暴露骨折断端,取机化血肿,组织块移行生长法分离出骨折血肿细胞;
　　 2.骨折血肿细胞离体培养:在α-MEM普通培养基(含10％热灭活胎牛血清(fetal bovine scrum,FBS)、2mmol/L L-谷氨酰胺、青霉素G100U/ml、链霉素100μg/ml)中,37℃、5%CO2条件下培养,待细胞生长至汇合时,0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化,传代;
　　 3.骨折血肿细胞鉴定:(1)形态观察:倒置相差显微镜下观察骨折血肿细胞活体细胞形态变化。(2)流式细胞仪(flow cytometer,FCM)检测骨折血肿细胞表面标志:测定整合素家族成员CD29(间充质干细胞相关标志)、CD14、CD34、泛白细胞标志抗原CD45和CD133(造血干细胞相关标志);
　　 4.实验分组:根据辛伐他汀药物浓度进行分组,对照组:A组(0mol/L);加药组:B组(1.0×10-9mol/L)、C组(1.0×10-8mol/L)、D组(1.0×10-7mol/L)、E组(1.0×10-6mol/L);
　　 5.骨折血肿细胞成骨诱导:以第三代骨折血肿细胞为研究对象,改用成骨诱导培养基(在α-MEM普通培养基中加入10nmol/L地塞米松、10mmol/L甘油磷酸酯、50μg/ml抗坏血酸(Sigma)),各组应用相同的成骨诱导培养基,但其含辛伐他汀药物浓度成梯度变化,分别处理骨折血肿细胞;
　　 6.成骨诱导过程中,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)比较各组骨折血肿细胞的增殖能力;
　　 7.成骨诱导过程中,比较各组细胞的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase.ALP)活性。通过检测骨折血肿细胞的ALP活性反映不同浓度辛伐他汀对骨折血肿细胞成骨分化潜能的作用;
　　 8.统计学方法:实验数据以均数±标准差(-x±s)表示,采用PASW Statistics18.0统计软件包对实验数据进行分析。各组间比较采用单因素方差分析(One-WayANONA)。P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　 结果:1.倒置相差显微镜观察骨折血肿细胞形态:细胞从组织块爬出后,细胞呈梭形纤维样细胞形态,8天左右可达90%融合,呈集落生长。传代细胞接种2～4小时迅速贴壁,伸展,重新恢复梭形等,24小时基本完成贴壁,细胞呈均匀生长,不再呈集落生长,细胞形态更加单一,排列规则,5～7天铺满瓶底,继续培养细胞叠加形成复层生长,无明显接触抑制。第3代细胞大小较均匀,呈梭形纤维样细胞形态,5～6天细胞达80%～90%融合,呈有序的漩涡状结构;
　　 2.FCM检测骨折血肿细胞表面标志:整合素家族成员CD29表达率为84.74%,CD14表达率为7%,CD34表达率为3%,CD45表达率为8%和CD133表达率为0;
　　 3.MTT法检测骨折血肿细胞增殖:实验结果显示:各加药组OD值与A组(对照组)比较,均有所增加,说明辛伐他汀对骨折血肿细胞增殖有促进作用。除B组和A组,C组和E组差异无显著性(P＞0.05)外,其余各组差异均有显著性(P＜0.05)。D组对骨折血肿细胞增殖促进作用最大,当辛伐他汀浓度超过1.0×10-7mol/L时,其刺激作用不再随浓度升高而增强;
　　 4.骨折血肿细胞的ALP活性测定:实验结果显示:各加药组OD值与A组(对照组)比较,均有所增加,说明辛伐他汀对骨折血肿细胞ALP活性有促进作用。除B组和A组,C组和E组差异无显著性(P＞0.05)外,其余各组差异均有显著性(P＜0.05)。D组对骨折血肿细胞增殖促进作用最大,当辛伐他汀浓度超过1.0×10-7mol/L时,其刺激作用不再随浓度升高而增强。
　　 结论:1.成功地从人骨折断端机化血肿中提取和培养了骨折血肿细胞,为研究各类药物对人骨折局部的作用提供了实验细胞模型;
　　 2.在体外一定浓度的辛伐他汀可促进骨折血肿细胞的增殖和ALP活性。其促进骨折血肿细胞增殖和增强ALP活性的作用,可能是辛伐他汀促进骨折愈合的机制之一。