乳腺癌干细胞发生机制的实验与临床病理研究

摘要

乳腺癌是全球女性恶性肿瘤死亡率最高的一种癌症,其确切的发病机制到目前尚未清楚。虽然当前乳腺癌的治疗水平较前有了很大的提高,但尚不能使大多数患者受益。癌症干细胞学说的出现为控制肿瘤细胞的恶性生长提供了一个研究方向。癌症干细胞学说认为癌症干细胞是在肿瘤形成组织中唯一具有无限增殖潜能并能促进肿瘤浸润生长的细胞,癌症的发生与干/祖细胞的恶性转化或自我更新机制失调有关。2003年,Al-Hajij等研究发现,200个CD44+CD24-/low/Lin-乳腺癌细胞接种NOD/SCID小鼠即可成瘤,而20000个不表达该类分子标记的乳腺癌细胞接种NOD/SCID小鼠均不能成瘤。同样,在前列腺癌干细胞领域,已建立的鼠移植模型显示CD44+细胞在增殖能力、克隆形成能力、肿瘤形成及转移等方面均强于CD24-细胞。Hedgehog(Hh)信号通路是一个高度保守的体系,负责动物发育模式的调控,并在调控干/祖细胞的正常生长和内环境稳定方面具有重要作用,肿瘤的发生与这一通路的异常激活有关。关于Hh信号通路在乳腺发育及乳腺癌发生发展中的确切作用机制还不清楚,但现有的研究结果表明Hh信号通路活化与肿瘤耐药、癌症干细胞的维持以及与其他信号通路相互作用等有关,了解Hh在乳腺肿瘤发生及恶性进展中的作用将为乳腺癌的防治提供新的靶标。本实验首先从乳腺癌MCF-7细胞系中分选出以CD44+CD24-为标志的乳腺癌干细胞,检测Hh信号通路分子在CD44+CD24-细胞和非CD44+CD24-细胞中的表达情况,了解Hh信号通路在乳腺癌干细胞中的作用。其次,将分选出的CD44+CD24-细胞和非CD44+CD24-细胞接种于NOD/SCID鼠乳腺部位,构建乳腺癌干细胞裸鼠模型,探讨乳腺癌的发生机制。用表达SMO shRNA的真核表达载体pGPU6/GFP/Neo瞬时转染MCF-7细胞,诱导SMO基因沉默,研究SMO基因对MCF-7细胞增殖、细胞周期及细胞周期蛋白cyclinD1和cyclinE的影响,探讨其在乳腺癌发生发展中的作用。最后,通过分析Hh信号通路分子在三阴性乳腺癌中的表达了解Hh信号通路在三阴性乳腺癌恶性生物学行为维持中的作用,以及分析Hh信号通路在乳腺癌、乳腺增生和正常乳腺组织中的表达,探讨Hh信号通路在乳腺癌发生机制中的作用。
　　 第一部分 Hedgehog信号通路分子在乳腺癌MCF-7细胞系干细胞中的表达及其作用机制
　　 目的:了解Hh信号通路在乳腺癌干细胞中的作用。
　　 方法:采用免疫磁珠法从无血清培养的乳腺癌悬浮细胞中分选CD44+CD24-细胞和非CD44+CD24-细胞。采用real-time RT-PCR技术检测Hedgehog信号通路分子SHH、PTCH1、SMO和GLI1 mRNA在CD44+CD24-细胞和非CD44+CD24-细胞中的表达情况。
　　 结果:分选出的CD44+CD24-细胞约占细胞总数的8.25％,分选出的CD44+CD24-细胞表达干细胞标志蛋白ALDH1A1和OCT-4。SHH mRNA、PTCH1mRNA、SMO mRNA和GLll mRNA在CD44+CD24-细胞中的表达量与CD44+CD24-细胞中的表达量相比,均有显著性增加(p均＜0.05)。
　　 结论:在CD44+CD24-细胞中Hh信号通路处于活化状态,活化的Hh信号通路可能有助于CD44+CD24-细胞形态及功能的维持。
　　 第二部分 乳腺癌干细胞裸鼠模型的建立及其发生机制的探讨
　　 目的:了解乳腺癌干细胞在乳腺癌发生发展中的作用。
　　 方法:将分选出的CD44+CD24-细胞和非CD44+CD24-细胞分别接种于去除脂肪垫的NOD/SCID鼠乳腺部位,观察肿瘤生长情况。
　　 结果:非CD44+CD24-细胞组NOD/SCID鼠成瘤率为50%(2/4),CD44+CD24-细胞组NOD/SCID鼠成瘤率为100%(3/3),但两组成瘤率并无显著性差异(p＞0.05)。病理学检查证实乳腺部位肿块均为乳腺癌。CD44+CD24-组1只NOD/SCID鼠发生肺转移,1只NOD/SCID鼠发生淋巴结转移和肺转移、1只NOD/SCID鼠发生肝脏转移和淋巴结转移,而非CD44+CD24-组2只乳腺癌NOD/SCID鼠均未见有转移发生。
　　 结论:乳腺癌干细胞NOD/SCID鼠乳腺癌模型建立成功。肿瘤细胞中的干细胞样细胞群与肿瘤发生及转移有关。
　　 第三部分 应用RNAi沉默Smoothened基因在乳腺癌发生发展中的作用
　　 目的:探讨Smoothened(SMO)基因表达在乳腺癌发生发展中的作用。
　　 方法:设计SMO shRNA,用于干扰并下调乳腺癌MCF-7细胞中目的基因的表达。以脂质体LipofectamineTM2000介导转染乳腺癌MCF-7细胞。转染后48h,采用实时定量RT-PCR技术检测转染细胞中SMO基因mRNA的转录水平,筛选有效的SMO shRNA质粒,Western blot检测SMO蛋白在乳腺癌MCF-7细胞中的表达。流式细胞仪检测转染后细胞周期变化,CCK-8法比较转染前后乳腺癌细胞增殖变化,实时定量RT-PCR检测SMO shRNA对cyclinD1和cyclinE mRNA表达的影响。
　　 结果:4个SMO shRNA表达载体SMO shTRNA-1、SMO shRNA-2、SMO shRNA-3和SMO shRNA-4经测序鉴定证明插入正确。转染48h后,在MCF-7细胞中SMO shRNA-1组、SMO shRNA-2组、SMO shRNA-3组、SMO shRNA-4组、空白对照组、阴性对照组、MOCK组的标化SMO mRNA水平分别为0.774±0.07、0.98±0.08、0.71±0.05、0.57±0.05、0.96±0.08、1.01±0.08、1.00±0.11,与MOCK组相比,SMO shRNA-1、SMO shRNA-3、SMO shRNA-4组SMO mRNA表达量均下降(p=0.015、0.002、0.000),其中转染SMO shRNA-4的MCF-7细胞中SMO mRNA表达水平低于SMO shRNA-1、SMO shRNA-2、SMO shRNA-3组(p=0.007、0.000、0.046)。SMO shRNA-4干扰抑制效率为87%。Western blot可检测到SMO在MCF-7中的表达,干扰片段SMO shRNA-4的抑制效果较好。与阴性对照组和空白对照组相比SMO shRNA-4组G1期细胞明显增多,S期细胞减少(p＜0.05)。转染SMOshRNA-4的MCF-7细胞增殖受到明显抑N(p=0.000),转染SMO shRNA后cyclinD1和cyclinE mRNA表达下降(p=0.000)。
　　 结论:shRNA可明显下调SMO mRNA和蛋白表达且对乳腺癌细胞增殖有明显的抑制作用,Hedgehog信号通路可通过活化cyclinD1和eyclinE诱导细胞恶性增殖。
　　 第四部分 Hedgehog信号通路分子在三阴性人乳腺癌中的表达及其发生机制中的作用
　　 目的:了解Hedgehog信号通路在三阴性乳腺癌中的表达及乳腺癌发生机制中的作用。
　　 方法:用免疫组织化学法检测SHH、PTCH1、SMO、GLI1蛋白在乳腺癌、乳腺增生及正常乳腺组织中的表达。
　　 结果:和非三阴性乳腺癌相比,SMO和GLI1在三阴性乳腺癌中的表达均明显增加。在三阴性乳腺癌中,GLI1表达在淋巴结转移阳性病例中明显增加,SHH和SMO的表达随着病理学组织分级的增加而增高,SMO和GLI1的表达随着病理分期的增高而增加而且GLI1的表达与ER呈负相关。SHH在正常乳腺上皮中表达稀少,但在乳腺癌和乳腺增生组织中均可频繁见到。PTCH1在乳腺癌中的表达均明显低于乳腺增生和正常乳腺组织,其表达在这三种组织中有明显差异。SMO和GLI1的表达在正常乳腺组织中均完全缺失,但在乳腺癌和乳腺增生组织中明显增加,而且这两种蛋白分别在三种组织中的表达均有明显差异。
　　 结论:Hedgehog信号通路在三阴性乳腺癌中激活并参与乳腺导管的恶性转化,抑制Hedgehog信号通路的激活可能有助于改善三阴性乳腺癌患者的预后。