RNA干扰抑制EphB4基因表达对胰腺癌PANC-1细胞的影响

摘要

目的：胰腺癌是一种恶性程度很高的消化系统肿瘤，它严重危害着人类的生命健康。由于它发病隐匿、进展迅速，传统治疗方法的效果不能令人满意，治疗困难，预后极差，因此研究出诊治胰腺癌的新方法显得尤为重要。近年来，随着基因治疗技术的迅速发展以及胰腺癌相关基因研究的不断深入，胰腺癌的基因诊断和基因治疗正在进一步的探索中。
　　 肿瘤的血管生长及形成是促进肿瘤发生发展和侵袭转移的重要因素，所以抑制胰腺癌的血管形成，降低胰腺癌组织中的血管含量，阻止其快速增长就显得尤为重要。EphB4受体促进了血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，参与调控胚胎期血管形成过程中的动静脉分化。目前，有文献报道EphB4受体在胰腺导管细胞癌中的高表达与肿瘤血管的生成及侵袭性有密切相关性。
　　 RNAi通过外源性或内源性的双链RNA（dsRNA），特异性结合了与ds-RNA序列互补的mRNA，诱导该mRNA的降解，沉默该基因的表达，属于转录后水平的基因沉默。目前，它的应用范围非常广，可用于肿瘤基因功能分析和调控信号转导通路等方面，为肿瘤的基因治疗提供新的目标和途径。
　　 本实验通过构建EphB4基因的siRNA真核表达载体，转染胰腺癌PANC-1细胞后，研究RNAi对PANC-1细胞EphB4基因的表达和细胞增殖、迁移行为的影响，为以后进一步研究胰腺癌基因治疗提供基础。
　　 方法：①软件分析EphB4基因的mRNA结构，筛选出拟干扰靶位点，构建EphB4基因的干扰质粒pSIREN-RetroQ-ZsGreen-EphB4和阴性对照质粒pSIREN-RetroQ-ZsGreen-N，经过测序鉴定后，提取重组质粒转染PANC-1细胞；②实验分成空白对照组、pSIREN-RetroQ-ZsGreen-EphB4组和pSIREN-RetroQZsGreen-N组，进行体外实验；③在重组质粒转染细胞48h后，用RT-PCR和Western-blot分别测定EphB4 mRNA和EphB4蛋白的相对含量，观察各重组质粒瞬时转染PANC-1细胞后对EphB4基因表达的影响；④MTT测定细胞增殖能力；⑤划痕迁移实验检测细胞的迁移能力。
　　 结果：①测序鉴定证明重组质粒pSIREN-RetroQ-ZsGreen-EphB4和pSIRENRetroQ-ZsGreen-N构建成功；②瞬时转染48h后，脂质体+干扰质粒组PANC-1细胞中EphB4 mRNA的表达水平较空白组、脂质体组、干扰质粒组和脂质体+对照质粒组显著下降(P＜0.05)；空白组、脂质体组、干扰质粒组和脂质体+对照质粒组四组间比较，差异不明显(P＞0.05)；③Western-blot法测定发现，脂质体+干扰质粒组PANC-1细胞中EphB4蛋白的表达水平较空白组和脂质体+对照质粒组显著下降(P＜0.05)；空白组和脂质体+对照质粒组两组间比较，差异不明显(P＞0.05)；④抑制EphB4基因的表达使PANC-1细胞的增殖能力有所减弱，细胞的迁移能力与对照组比较有所下降。
　　 结论：成功构建靶向EphB4的siRNA真核表达载体并有效转染胰腺癌PANC-1细胞。干扰质粒能有效地抑制胰腺癌PANC-1细胞EphB4基因的mRNA和蛋白表达，同时PANC-1细胞的体外增殖和迁移能力明显下降。