重组白眉腹蛇去整合素Adinbitor对人非小细胞肺癌A549细胞的抑制作用

摘要

目的:肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,对放疗、化疗敏感性均较差。因此,从生物体内寻找高效、低毒的抗肿瘤药物已成为抗肿瘤研究及新药开发的重要组成部分。
　　 去整合素(disintegrins)是一类存在于多种蛇毒(主要是蝰科和蝮科)和水蛭毒素中的抗粘附蛋白质,其典型特征为:富含半胱氨酸,并含有Arg-Gly-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)亲水性氨基酸序列,分子量为5 kD～9kD,多为单一肽链的蛋白分子。因为大多数细胞整合素(integrins)都能识别RGD或KGD序列,而此蛇毒蛋白家族可凭借其RGD分子序列而成为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)与细胞整合素间结合的强有力的竞争性拮抗剂,具有抑制血小板聚集和血管新生、肿瘤转移等功能。Adinbitor是本实验室从中国旅顺白眉蝮蛇的毒腺中通过基因克隆的方法获得的一种含有RGD模体的去整合素,经实验证实,它具有抑制血小板聚集和血管新生功能,并具有显著抑制肿瘤生成的作用。本研究旨在探讨Adinbitor对人非小细胞肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响,为其研制开发成新的抗肿瘤药物提供理论依据。
　　 方法:本研究所用的分子量9KD的去整合素Adinbitor,是本实验室经过组氨酸亲和层析柱纯化的高浓度蛋白。1.运用体外培养的方法,采用不同浓度的Adinbitor(0,1,2,3,4,5,6μmol/L)和10ng/L TNF-α、TNF-α(10ng/L)/Adinbitor(3μmol/L,)作用人非小细胞肺癌A549细胞,应用噻唑蓝(MTT)法测定Adinbitor及TNF-α对细胞增殖的影响;2.采用3μmol/L Adinbitor和10ng/L TNF-α、TNF-α(10ng/L)/Adinbitor(3μmol/L)处理A549细胞,应用苏木精-伊红(HE)染色方法结合相差显微镜观察细胞凋亡形态学变化,进一步采用Hoechst染色方法结合荧光显微镜观察Adinbitor及TNF-α对A549细胞凋亡的影响;3.用Western blot检测Adinbitor和TNF-α对A549细胞中IL-8、NF-κB p65表达的影响。
　　 结果:1.通过MTT方法检测,Adinbitor可呈剂量依赖性方式抑制A549细胞的增殖,其抑制细胞增殖的IC50为3.28μmol/L;2.TNF-α可以促进细胞增殖,而Adinbitor对TNF-α诱导的增殖有抑制作用;3.通过相差显微镜HE染色和Hoechst染色法观察到Adinbitor促进TNF-α作用的细胞产生凋亡;4.Western blot方法检测到TNF-α作用的细胞中IL-8和NF-κB p65表达增加,而Adinbitor可下调IL-8和NF-κB p65的表达。
　　 结论:综上所述,本实验通过诱导表达并纯化获得了重组蛋白即去整合素Adinbitor,在体外研究其对人非小细胞肺癌A549的作用。实验结果表明:Adinbitor对非小细胞肺癌A549的增殖抑制具有剂量依赖关系,TNF-α可诱导A549细胞增殖,而Adinbitor对TNF-α诱导的细胞增殖具有抑制作用;TNF-α作用的细胞中IL-8的表达增加,Adinbitor下调TNF-α作用的细胞中IL-8的表达;Adinbitor促进含有TNF-α的细胞凋亡;TNF-α可以增加细胞中NF-κB p65的表达,而Adinbitor可抑制其表达。这些结果提示,Adinbitor抑制TNF-α诱导的A549细胞增殖可能是通过抑制IL-8表达实现的,而对凋亡的抑制可能是通过抑制NF-κB p65的表达而发挥生物学效应。这为探讨Adinbitor对信号转导途径的调控提供了实验依据,并将为深入探讨其抗肿瘤作用分子机制开辟新思路。