AQP4基因沉寂治疗早期缺氧缺血性脑水肿的DWI影像学研究

摘要

目的:通过观察早期磁共振弥散加权成像(diffusionweightedimaging，DWI)图像及表观弥散系数（ApparentDiffuseCoefficient，ADC）图像的影像特点并监测ADC值的变化规律，从而探讨水通道蛋白-4（Aquaporin-4，AQP4）基因沉寂对新生猪缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD)的干预效果，进而研究早期缺氧缺血性脑损伤AQP4mRNA表达的变化及意义。
　　 材料与方法:新生健康清洁级约克种猪40只（日龄3-5天，体重1.3-1.6kg，雌雄不限，由大连华侨种猪场提供）随机分成实验组及对照组（每组20只）。其中12只种猪（实验组5只及对照组7只）在实验过程中由于缺氧、手术创伤等原因死亡，实验组中2例因注射药物失败列入对照组，最终实验组13例、对照组15例。实验组给予脑室注射siRNA-AQP4（AQP4干扰序列）+缺氧缺血（双侧颈总动脉永久结扎+4％低氧通气30min），对照组给予siRNA-Negative（AQP4非干扰序列）+缺氧缺血。术后给予青霉素肌肉注射预防感染。两组种猪均根据具体情况酌情喂养，以保证充足的热量及液体供给。
　　 模型制备结束后，采用1.5TMR扫描仪扫描，使用标准头线圈，冠状位扫描。分别在缺氧缺血后0h、1h、3h、6h、9h及12h时间点进行MR扫描;扫描序列包括T1加权像(T1WI)、T2加权像(T2WI)、FLAIR及DWI。其中DWI扫描参数如下:TR6000ms，TE91.1ms，层厚4mm,2次采集，矩阵128×128，b值分别为0/1000s/mm2。将采集后的原始图像传送至GEadvantageworkstationAW4.4工作站上进行后处理，分别于双侧大脑半球额叶皮层、脑室旁及海马区域选择感兴趣区(Regionsofinterest，ROI)，测量并得到ADC值。
　　 所有时间点扫描结束后给予3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后断头取脑。一侧脑组织进行SP免疫组织化学染色，光镜下观察病理改变;另一侧行实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测，观察脑组织中目的基因的表达情况，检测待测样品的Ct值。
　　 应用社会科学统计软件包(statisticspackageforsocialscience，SPSS)16.0版进行数据分析:对两组间不同部位及不同时间点的ADC值进行重复测量方差分析方法进行检验;对两组间相同部位AQP4mRNA相对表达量及Ct值进行独立样本T检验;对两组的不同部位间AQP4mRNA相对表达量及Ct值进行配对样本T检验。
　　 结果:
　　 1.实验组大脑额叶皮层、海马区及侧脑室旁区域未见明显高信号，且各时间点ADC值无统计学差异(p＞0.05);对照组各区域出现不同程度高信号，相应的ADC值均不同程度的减低，表现为:1小时内下降明显，3小时最低，6小时开始回升，12小时接近正常，且各时间点之间差异有统计学意义(p＜0.05)。同一区域对照组各时间点ADC值较相应实验组均减低，且有统计学意义(p＜0.05)。
　　 2.独立样本T检验结果显示:两组间海马区AQP4mRNA相对表达量明显不同，实验组低于对照组（相对表达量=0.80，1.48），且两组间差异有统计学意义(p=0.04);实验组脑室旁区AQP4mRNA相对表达量同样低于对照组（相对表达量=0.69，1.10），但差异没有统计学意义(p=0.31)。实验组海马区及侧脑室旁区Ct值较对照组均增高（海马区=20.62，18.47;侧脑室旁区=20.53，18.93），但这些差别缺乏统计学意义(p=0.05，0.92)。
　　 3.配对样本T检验结果显示:海马区相对表达量明显高于侧脑室旁白质区域（均差=0.25），且两者差异有统计学意义(p=0.00);海马区Ct值较脑室旁白质区域减低（均差=-0.21），但差异没有统计学意义(p=0.09)。
　　 结论:
　　 1.新生猪HIE模型可操作性好。双侧颈总动脉结扎+4％低氧通气30min可以造成程度较为一致的HIE，为研究新生儿HIE提供较为可靠的动物模型。
　　 2.DWI在诊断早期缺氧缺血性脑水肿并揭示其微观病理生理学的演变规律有明显的优势。ADC值从病理生理水平反映了早期缺氧缺血性脑水肿的变化规律。
　　 3.AQP4的表达与HIBD脑水肿病理变化的发生发展有关。在缺氧缺血性脑水肿早期干预AQP4基因可以预防脑水肿的发生。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1．缺氧箱设置

2．动物模型的制备

3．MRI设备与检查方法

4．数据处理及分析

5．免疫组织化学检测

6．RT-PCR检测AQP4 mRNA的表达

7．统计学方法

结果

1．新生猪缺氧缺血后早期的行为学改变

2．MRI扫描结果

3．ADC图及ADC值变化

4．免疫组织化学AQP4蛋白表达情况

5．荧光定量PCR结果

讨论

1．HIE的病理生理机制

2．脑水肿与DWI相关分析

3．AQP4与脑水肿的相关研究

4．研究的局限性

结论

参考文献

综述

附录

致谢