磁共振活体评价AQP4基因沉寂治疗早期缺血缺氧性脑损伤

摘要

新生儿缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是引起新生儿急性死亡和儿童智力低下、脑瘫和癫痫等神经系统损伤的主要原因之一，而脑水肿是脑细胞死亡的早期病理改变，其有效防治临床意义重大。水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP4）在脑水平衡和中枢渗透压调解中起重要作用，是脑水肿发生、发展的决定性因素。近十年基因治疗的研究进展迅速，新生大鼠AQP4基因敲除可减轻水中毒和局部缺血缺氧所引起的脑水肿症状，这为脑水肿的治疗提供了新的思路。但基因治疗的评价方法仍然难以令人满意，如何对基因表达进行无创伤的评价是基因治疗所必须面对的关键问题。磁共振扩散成像(diffusion weightedimaging，DWI)是目前在活体上进行水分子扩散测量与成像的唯一方法，并提供可以量化的表观弥散系数(apparent diffuse coefficient，ADC)，这为在活体完整的微循环状态下研究脑水肿病理机制及评价基因治疗效果开辟了一条新路。
　　RNA干扰技术(RNAi)是近年来产生的特异性基因阻断生物技术，能够快速、高效地下调特异基因的表达，是一种简单地可代替基因敲除的分子生物学研究工具。为了进一步在活体研究AQP4在HIE脑水肿形成中的作用机制及评估AQP4基因沉寂对缺血缺氧性脑水肿的治疗效果，我们拟用生后3～5天的约克种猪为动物模型，建立新生猪缺血缺氧脑损伤模型，利用RNA干扰技术，通过脑脊液注射给药途径将siRNA导入动物体内，采用3.0T磁共振扫描仪观察缺血缺氧后不同时间的脑MRI变化，为研究HIE脑水肿的发生机制及治疗方法寻求新线索。
　　目的:
　　1.观察新生猪急性缺氧缺血脑损伤(hypoxicschemic brain damage,HIBD)早期DWI图像及ADC值的变化规律。
　　2.探讨新生猪早期HIBD过程中ADC值与AQP4表达的相关性
　　3.探讨DWI活体评价AQP4基因沉寂对新生猪HIBD的治疗效果。
　　方法:
　　1.选择新生约克猪随机分为实验组10只，对照组12只，实验组进行HIBD模型制备，对照组仅行假手术，分别在缺氧缺血前及缺氧缺血后1h、3h、6h、9h和12h进行常规MR扫描和DWI检查，得到TIWI、T2WI、T2-flair、DWI图像和相应ADC图，观察图像变化，并选择皮层及皮层下、侧脑室旁区、海马区三部分进行ADC值测量，实验组在缺血缺氧后各时间点MR检查后各处死2只，取脑做病理学检查，处死前做神经行为学评分。
　　2.选择新生约克猪随机分为实验组、对照组各24只，实验组进行HIBD模型制备，对照组仅行假手术，分别在缺氧缺血前及缺氧缺血后1h、3h、6h、9h和12h进行MR扫描，得到DWI图像和相应ADC图，观察DWI图像变化，并选择皮层及皮层下、侧脑室旁区、海马区三部分进行ADC值测量，实验组和对照在缺血缺氧后各时间点MR检查后各处死4只，取脑做免疫组织化学分析，检测AQP4蛋白表达情况。
　　3.选择新生约克猪随机分为A组（实验组）11只，B组（对照组1）11只，C组（对照组2）6只，D组（对照组3）4只。A组给予脑脊液注射siRNA-AQP4和缺血缺氧，B组给予脑脊液注射siRNA-Negative（AQP4非干扰序列）和缺血缺氧，C组给予脑脊液注射siRNA-Negative（AQP4非干扰序列）和假手术，D组不做任何处理。各组分别在缺氧缺血前及缺氧缺血后1h、3h、6h、9h和12h进行MR扫描，得到DWI图像和相应ADC图，观察DWI图像变化，并选择皮层及皮层下、侧脑室旁区、海马区三部分进行ADC值测量，并进行神经行为学评分，各组动物均在12h后取脑，然后进行免疫组织化学分析及Real Time PCR检查，检测AQP4蛋白及AQP4mRNA表达情况，缺血缺氧前及缺血缺氧后12h抽取动脉血行血气及脑酶学检查。
　　结果:
　　1.实验组在缺血缺氧后各时间点神经行为学评分较对照组降低显著(P＜0.05)，新生猪HIBD模型制备成功，实验组和对照组TIWI、T2WI、T2-flair图像均未见异常信号。实验组在缺血缺氧后1h，DWI图像上开始出现点状高信号区，随时间延长，在缺血缺氧后3h、6h、9h各点的DWI图像上，高信号区范围和强度明显扩大，主要分布于大脑皮层、侧脑室旁区及海马区，缺血缺氧后12h，DWI图像显示脑内呈弥漫性高信号改变。实验组各部位ADC值1h下降明显，3h最低，6h、9h、12hADC值回升，但仍明显低于缺血缺氧前ADC水平。对照组在不同时间DWI图像及ADC值未见异常改变。在缺血缺氧后1h、3h、6h、9h及12h，实验组ADC值较对照组ADC值降低，差异显著(P＜0.05)。病理学显示缺血缺氧后1h部分细胞内即出现水肿，3h细胞内水肿加重，范围增大，6h出现少许血管源性水肿，至12h，血管源性水肿逐渐加重，但仍以细胞内水肿为主。
　　2.免疫组织化学分析显示，实验组侧脑室旁区、海马区AQP4蛋白在缺血缺氧后1h、3h、6h、9h、12h各时间点表达量较对照组增多，差异显著(P＜0.05)，并与相应时间点ADC值呈负相关(P＜0.05)。
　　3.A组、C组、D组在各时间点DWI图像上未见明显异常高信号，B组在各时间点DWI表现同前两项研究结果，A组各部位ADC值在缺血缺氧后各时间点轻微降低，12h几乎恢复正常，较B组各时间点ADC值增高，差异显著(P＜0.05)。神经行为学评分显示:A组在缺血缺氧后各时间点较B组评分增高，差异显著(P＜0.05)。免疫组织化学检查显示A组较B组AQP4蛋白着色细胞数量减少，RealTime PCR检查结果显示:A组海马区较B组海马区AQP4mRNA相对表达量明显减少，差异显著(P＜0.05);A组侧脑室旁区较B组侧脑室旁区AQP4mRNA相对表达量减少，但差异不显著(P=0.25);A、B组海马区AQP4mRNA相对表达量较侧脑室旁区增多，差异显著(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.DWI是新生猪HIBD早期影像检查中敏感、有效的检查方法，ADC值的变化较DWI图像更能反映HIBD早期的病理生理变化。
　　2.AQP4在新生猪HIBD早期过程中高表达，并与ADC值呈显著负相关。
　　3.RNAi可有效抑制新生猪缺血缺氧后AQP4基因表达，减轻HIBD症状，可作为基因治疗的有效手段。
　　4.海马区AQP4表达较侧脑室旁区增多，可作为海马较其它部位对缺血缺氧敏感的基础之一。
　　5.ADC值测量可作为活体动态评价AQP4基因沉寂治疗HIBD的有效方法。

目录

声明

摘要

第一部分 新生猪早期缺血缺氧性脑损伤的DWI影像与病理研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 新生猪早期缺血缺氧性脑损伤ADC与AQP4相关性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 DWI评价AQP4基因沉寂治疗新生猪早期缺血缺氧性脑损伤

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

文献综述一 磁共振弥散加权成像在d,JL中枢神经系统疾病中的应用

文献综述二 AQP4和脑水肿

攻读学位期间发表论文情况

致谢