组氨酸激酶DRK1在申克孢子丝菌双相转换及致病性形成中的作用及黄芪抗小鼠孢子丝菌感染机制的初探

摘要

在人类生存的环境中存在超过100，000种不同类型的真菌，其中双相性致病真菌有:皮炎芽生菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌、马尔尼非青霉菌和申克孢子丝菌。双相真菌的孢子入侵宿主体内后其形态便会由体外环境中非致病的菌丝形态转换为体内环境中致病的酵母形态。与其他5种双相真菌相比，孢子丝菌病的发病率最高，可引起皮肤、皮下组织以及附近淋巴管的慢性感染，导致化脓、溃烂及渗出，偶可累及肌肉、骨骼、中枢神经系统等脏器。孢子丝菌病的病原体为申克孢子丝菌，具有双相性:25℃为菌丝相，呈灰白至棕褐色霉菌样菌落生长，镜下为细长的分隔菌丝、未分化的菌丝形成的产孢细胞及由其产生的小的，簇集分布的分生孢子组成。菌丝相的分生孢子不会出芽形成酵母细胞，不具致病性;37℃为酵母相，呈奶油或棕褐色酵母样菌落生长，镜下为圆的或卵圆形酵母样细胞，窄的基底上可发出细长雪茄样的芽，与感染组织病理切片中的菌体形态一致，具有致病性。孢子丝菌由菌丝相转化为酵母相的过程被认为是孢子丝菌致病性形成的过程，对孢子丝菌形态转换过程的深入研究有助于揭示孢子丝菌病的发病机制。双相真菌的形态转化是一个多因素共同参与的复杂过程，是真菌通过其信号传导系统感受并将变化了的环境信号因子级联传递至细胞内，引起特定的基因表达进而行使功能的过程。既往的研究中本课题组曾应用比较蛋白质组学的研究方法比较了孢子丝菌菌丝相及酵母相的蛋白表达图谱，鉴定了24个酵母相特异或上调表达的蛋白质，其中包括双组份信号系统组氨酸激酶DRK1基因，为了进一步探讨DRK1在孢子丝菌双相转化和致病性形成中的作用，我们进行了本文的研究。
　　 目的:
　　 1，克隆孢子丝菌组氨酸激酶DRK1的基因。
　　 2，构建一种由根癌农杆菌介导的适于多种丝状真菌基因研究用的RNA干扰载体。
　　 3，研究DRK1基因在孢子丝菌菌丝及酵母细胞生长、菌丝相向酵母相转化、细胞壁组成、下游基因表达以及孢子丝菌致病性形成等方面的影响。
　　 4，明确中药黄芪在调节宿主免疫状态及孢子丝菌病辅助治疗中的潜在功效。
　　 方法:
　　 1、通过RACE技术获得组氨酸激酶DRK1的cDNA全长，克隆DRK1的基因组全长，对二者进行比对找出内含子，鉴定DRK1基因的功能结构域。
　　 2、依次构建中间载体PCB301、PCB309、PUC-PUT、PUC-PDUDT，导入真菌通用启动子PtrpC、终止子TtrpC、发夹结构gus基因、潮霉素抗性基因Hypr、DRK1正反向干扰序列，最终构建干扰载体PCB309-PDUDT。优化农杆菌转化宿主的反应体系，分别确定诱导培养基诱导剂的种类和浓度、诱导培养时间以及筛选培养基最佳的潮霉素浓度等参数。
　　 3、通过比较野生标准株，空转株（转化空载体PCB309）及DRK1基因干扰株在菌落生长速度、菌落形态、光镜电镜结构、刚果红敏感性、Zymolyase敏感性、下游基因Ste20/cAMP表达水平、小鼠感染模型局部皮损炎症细胞浸润情况等诸方面的差异，明确DRK1基因在孢子丝菌双相转化和致病性形成中的作用。
　　 4、通过比较黄芪给药组及非给药组孢子丝菌小鼠感染模型局部皮损炎症细胞浸润程度的差异，明确黄芪在调节宿主免疫状态及孢子丝菌病辅助治疗中的潜在功效。
　　 结果:
　　 1、完整的申克孢子丝菌DRK1cDNA全长为4743bp，开放阅读框为4071bp，编码1356个氨基酸序列，分子量为147.3kDa，等电点为5.46。与皮炎芽生菌DRK1基因的相似度为65％。孢子丝菌DRK1功能域的分析结果证实其由信号感受区，连接区及功能区三部分组成，是一种可溶性组氨酸蛋白激酶，未发现跨膜区。
　　 2、成功的构建了长为8825bp的干扰载体PCB309-PDUDT。优化了农杆菌介导的转化体系:诱导培养基中乙酰丁香酮的浓度为200μ mol/L，诱导培养条件为25℃避光培养48h，筛选培养基中潮霉素浓度为100mg/L。应用上述载体及转化体系成功的实现了对孢子丝菌组氨酸激酶DRK1基因的干扰，干扰后其基因表达水平下调89％。
　　 3、DRK1基因表达水平下调后孢子丝菌的菌落生长延缓，直径由1.1cm降至0.6cm;黑色素产生减少，干扰株的混悬液颜色明显变淡;菌丝生长受抑制，培养96H后菌丝干重由2.9689g降至0.9274g;孢子生成减少，培养1W后孢子混悬液分光光度值由1.15降至0.55;菌丝及孢子的细胞壁变粗糙、疏松;细胞壁的组成成分发生变化，对刚果红及Zymolase的敏感性增加;下游传导通路基因Ste20、cAMP表达水平明显下调，分别下调了83％和73％;菌株的毒力降低，所致皮损处的炎症反应轻微，野生标准株及干扰株感染小鼠局部皮损浸润的中性粒细胞数分别为97.5±10和29.4±5，单核细胞分别为90.2±8和30.0±4，均具有显著性差异。
　　 4、中药黄芪可调节小鼠宿主的免疫机能，减轻孢子丝菌感染小鼠的炎症反应，用药前后局部皮损浸润的中性粒细胞数分别为97.5±10和75.7±2，单核细胞分别为90.2±8和72.0±2，均具有显著性差异。
　　 结论:
　　 1、孢子丝菌的DRK1为长4743bp，编码1356aa的膜内可溶性组氨酸蛋白激酶。
　　 2、构建了一种由根癌农杆菌介导的适于丝状真菌基因RNA干扰的方法。
　　 3、DRK1基因在孢子丝菌生长、形态形成、细胞壁组成及致病性形成中均具有重要作用，并位于信号传导通路MAPK及cAMP-PKA的上游。
　　 4、黄芪注射液可调节小鼠宿主的免疫机能，可能在孢子丝菌病的治疗中发挥潜在的辅助作用。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 组氨酸蛋白激酶DRK1基因全长的序列测定

材料与方法

1、材料

2、方法

结果

1、DRK1保守区域的扩增

2、两个保守区域间区的序列扩增

3、3’RACE的PCR扩增

4、5'RACE的PCR扩增

5、DRK1全长拼接序列

6、DRK1氨基酸序列推导

7．组氨酸蛋白激酶DRK1结构域的鉴定

8、孢子丝菌DRK1与其他真菌组氨酸激酶氨基酸序列的比对

9、实时定量PCR检测DRK1在菌丝相与酵母相中的表达水平

讨论

第二部分 组氨酸激酶DRK1基因RNA干扰菌株的构建

材料与方法

1、实验材料

2、实验方法

结果

1、干扰载体构建过程中涉及到的酶切及PCR鉴定图

2、PCB301全序列及PCB309-PDUDT的测序验证

3、确定申克孢子丝菌对潮霉素的敏感性

4、应用Real Time PCR方法进行申克孢子丝菌组氨酸激酶DRK1基因相对表达量分析

讨论

第三部分 组氨酸激酶DRK1基因功能的研究

材料与方法

1、实验材料

2、试验方法

结果

1、组氨酸激酶基因沉默后孢子丝菌的表型变化

2、DRK1基因干扰对孢子丝菌菌丝相酵母相转化的影响

3、DRK1基因对孢子丝菌超微结构的影响

4、DRK1-i对细胞壁组分合成的影响

5、DRK1对下游调控基因的影响

6、动物实验结果

讨论

第四部分 黄芪抗小鼠孢子丝菌感染机制的初探

材料与方法

1、实验材料

2、试验方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

附录

缩略语表

攻读学位期间发表论文情况

致谢