脂肪源性干细胞对冻伤创面愈合作用的研究

摘要

目的:提取脂肪源性干细胞(ASCs)并培养;观察干细胞形态及生长传代情况;建立SD大鼠局部冻伤模型;探索脂肪源性干细胞对局部冻伤的治疗作用，为冻伤治疗探索新思路。
　　 方法:切取双侧腹股沟皮下脂肪组织。用酶消化法提取ASCs，L-DMEM培养基培养，1×105个/ml接种于培养皿。利用倒置显微镜对原代细胞进行形态学观察，培养干细胞至第三代，并应用流式细胞仪鉴定。不同终浓度的5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-BrdU）标记ASCs，并行细胞免疫荧光染色，于荧光显微镜下观察标记情况;建立SD大鼠冻伤模型:于动物背部设计直径22mm的圆形创面，通过手动制压泵将液氮匀速泵出喷射于实验区，致伤时间分别为0s、3s、5s、8s。致冻次日应用激光多普勒血流探测仪测定血流灌注量并行统计学分析。处死动物后行皮肤组织HE染色。于致冻后3d，1w，2w对8只SD大鼠32个创面进行大体观察。采用含5-Brdu标记的第三代干细胞（浓度1×106/ml）1ml应用于冻伤SD大鼠，A组空白对照组，B组经尾静脉注入经5-Brdu标记的ASCs悬液1ml，C组经尾静脉注射0.9％氯化钠注射液1ml，D组局部注射5-Brdu标记的ASCs悬液，E组局部注射0.9％氯化钠注射液1ml，分别于移植术后7d，14d处死大鼠，切取冻伤创面进行组织固定，石蜡包埋，切片，HE染色及免疫荧光染色。观察移植细胞参与创面愈合的情况。
　　 结果:细胞呈成纤维细胞样生长，原代培养的细胞7～10d即达80％以上融合。可进行常规传代培养。流式细胞仪鉴定第三代细胞表达:CD29、CD44表达阳性，CD31、CD45表达呈阴性。应用手动液氮制压泵致冻时间8s可造成SD大鼠背部皮肤重度冻伤创面。10mmol/L5-BrdU体外标记第三代ASCs，孵育48h后标记率达80％左右。5-Brdu体内示踪实验组:细胞移植14d后大鼠创面局部及边缘可见5-BrdU标记的阳性细胞聚集;对照组中未发现明显的聚集现象;抗5-BrdU/FVIII、抗5-BrdU/波形蛋白免疫双标技术检测结果显示:在创伤部位有部分ASCs分化，提示血管内皮细胞和成纤维细胞参与创面愈合。
　　 结论:ASCs取材方便，体外培养及扩增迅速，具有干细胞特性。应用手动液氮制压泵致冻8s可建立标准重度冻伤模型。SD大鼠自体脂肪源性干细胞参与冻伤创面愈合。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 SD大鼠冻伤模型的建立

材料与方法

一、实验动物

二、主要试剂及仪器

三、实验方法

结果

1．冻伤大体观

2．组织HE染色

3．灌注量变化分析

讨论

第二部分 BrdU标记ASCs最适条件的研究

材料与方法

一、实验动物

二、主要试剂及仪器

三、实验方法

结果

1．大鼠ASCs体外分离培养

2．流式细胞仪鉴定结果显示

3．BrdU标记的ASCs HE染色显示

4．Brdu细胞免疫荧光

5．BrdU标记率分析

讨论

实验三 脂肪源性干细胞治疗对冻伤创面的影响

材料与方法

一、实验动物

二、主要试剂及仪器

三、实验方法

结果

1．大体观察

2．创面微血管密度观察

3．免疫荧光染色

4．双标染色

讨论

结论

参考文献

综述

攻读学位期间发表论文情况

致谢