表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人肝癌细胞的抑制作用

摘要

肝癌是世界上最常见的五大恶性肿瘤之一，肝癌的死亡率占癌症死亡率的第三位。手术治疗目前是治疗肝癌的有效方式，但对于癌转移病人的治疗效果有限。如果找到能够具有抑制肿瘤生长和转移双重功能的药物，对于癌症的早期治疗以及配合手术治疗的药物治疗将具有重要意义。已有研究表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechingallate，EGCG)能抑制一些癌细胞的转移和诱导癌细胞凋亡，故本实验选用具有高转移性质的人肝癌细胞HCCLM6作为体外模型，研究EGCG的体外抗肿瘤作用。本实验的目的是从细胞凋亡、细胞转移、蛋白质组学方面探讨EGCG对肝癌细胞的抑制作用，并对其抑制作用机制进行了初步研究，为今后的动物实验和临床应用提供参考。
　　 首先，本课题从诱导细胞凋亡的角度检测EGCG对人肝癌细胞HCCLM6和人正常肝细胞HL7702的抑制作用，并探讨EGCG诱导肝癌细胞凋亡的分子机制。MTT法检测EGCG对HCCLM6细胞和HL7702细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测EGCG对HCCLM6细胞和HL7702细胞凋亡率、细胞周期和线粒体膜电位的影响;Western-bloting检测EGCG对HCCLM6细胞和HL7702细胞Bcl-2，NF-kB，Bax，P53，caspase-9，caspase-3和cytochrome-c蛋白表达的影响。结果显示EGCG(10-100μg/ml)能显著抑制HCCLM6细胞的增殖作用并呈一定的剂量依赖性;EGCG从80μg/ml开始对HL7702细胞有显著抑制作用。EGCG（10，30μg/ml）可以诱导肝癌细胞HCCLM6凋亡，降低其线粒体膜电位，阻滞细胞周期于G0/G1期;EGCG(10，30μg/ml)不能诱导人正常肝细胞HL-7702的凋亡，对其线粒体膜电位和细胞周期也没有明显影响。该浓度下EGCG处理HCCLM6细胞后，Bcl-2和NF-kB蛋白表达显著下降，Bax，P53，caspase-3和caspase-9蛋白的表达显著升高，cytochrome-c由线粒体向细胞质释放;但EGCG作用前后HL-7702细胞后这些蛋白的表达均无明显影响。这些结果表明EGCG可以选择性作用于肝癌细胞，同时不影响正常肝细胞的功能。EGCG主要通过线粒体途径引起HCCLM6细胞凋亡。所以在诱导肿瘤细胞凋亡方面，EGCG可以作为一个潜在的治疗肝癌的药物。
　　 其次，本研究旨在检测EGCG对HCCLM6细胞转移的抑制作用，并探讨EGCG抑制HCCLM6细胞转移的作用机制。用体外迁移和侵袭实验模拟HCCLM6细胞的体内转移行为，检测EGCG对细胞转移的影响;用明胶酶谱法和RT-PCR法探讨EGCG抑制HCCLM6细胞转移的机制。迁移和侵袭实验结果显示EGCG(5，10μg/ml)能显著抑制HCCLM6细胞的侵袭和迁移;明胶酶谱法显示EGCG(5，10，20μg/ml)能显著抑制HCCLM6细胞中MMP-2和MMP-9的活性;RT-PCR结果表明EGCG(10，20μg/ml)能显著抑制HCCLM6细胞中MMP-2和MMP-9的mRNA水平。推测MMP-2和MMP-9的活性的降低可能与EGCG抑制HCCLM6细胞转移有关。本研究显示EGCG具有抑制肿瘤细胞转移的功能，提示EGCG可能成为一个治疗肝癌的潜在药物。
　　 最后，为进一步探讨EGCG对HCCLM6细胞的抑制作用机制，本课题采用蛋白质组学方法，对EGCG作用HCCLM6细胞前后进行蛋白质组学分析，发现了35个蛋白点在EGCG处理后发生可重复的显著变化，其中11个蛋白点被上调，24个被下调。选4个变化明显的差异蛋白点，经MALDI-TOF/MS分析，利用得到的质谱数据进行肽指纹图谱分析后，被鉴定为FUBP1，HSPB1，NPM和CH60。已有文献报道这四种蛋白与细胞的转移和凋亡有关，故推测EGCG通过下调FUBP1、HSPB1、CH60的表达、上调NPM的表达来引起HCCLM6细胞凋亡和（或）抑制细胞的转移。蛋白质组学研究结果印证了前期实验结果对EGCG对于肝癌细胞作用机制的推测。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)诱导人肝癌细胞和正常肝细胞凋亡功效的比较

材料

1 实验材料

方法

2 实验方法

结果

讨论

小结

第二部分 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人肝癌细胞转移的抑制作用

材料

1 实验材料

方法

2 实验方法

结果

讨论

小结

第三部分 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人肝癌细胞蛋白质组学的影响

材料

1 实验材料

方法

2 实验方法

结果

讨论

小结

结论

参考文献

综述

附录

致谢