铜绿假单胞菌的整合子检测及其与耐药相关性的研究

摘要

目的:了解威海地区铜绿假单胞菌临床连续分离株耐药情况、整合子的携带率及其基因盒类型。分析整合子在铜绿假单胞菌耐药中发挥的作用，为指导临床合理应用抗菌药物、有效预防和控制耐药细菌感染提供科学依据。
　　 方法:采用Microscanwalkway40S全自动微生物分析仪和API板条对威海市立医院2012年5月、6月临床分离的92株铜绿假单胞菌进行鉴定，Kirby-Bauer纸片扩散法进行药物敏感试验。使用聚合酶链反应(PCR)及核酸克隆测序等方法分析整合子的携带率及其基因盒类型，对药敏结果和耐药基因检测结果进行综合分析。
　　 结果:
　　 1、威海地区铜绿假单胞菌的总体耐药率较低。β-内酰胺类药物耐药率大于5％的有头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮钠舒巴坦钠（舒普琛）、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑肟，耐药率分别为71.8％、76.1％、13.0％、8.6％、6.5％、6.5％。β-内酰胺类药物耐药率小于5％的有头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、阿莫西林/棒酸、头饱西丁、头孢呋辛、氨曲南、替卡西林/棒酸等。氨基糖苷类药物如阿米卡星耐药率为:10.9％。喹喏酮类药物如环丙、左氧的耐药率分别为10.9％、10.9％。
　　 2、整合子中只有Ⅰ类整合子阳性，未发现Ⅱ、Ⅲ类整合子。有12株铜绿假单胞菌用PCR方法扩增出Ⅰ类整合子基因，Ⅰ类整合子扩增阳性率13％(12/92)。其中染色体上Ⅰ类整合子阳性率6.5％(6/92);质粒上Ⅰ类整合子阳性率为8.6％(8/92)。有两株菌质粒和染色体上同时扩增出Ⅰ类整合子，而且整合子的可变区PCR扩增产物大小相同，说明该菌的染色体上的整合子和质粒上的整合子携带相同的耐药基因盒。测序结果表明在Ⅰ类整合子中携带的耐药基因盒共有6种，分别介导对β内酰胺类、氨基糖苷类及氯酶素类抗生素耐药。耐药基因盒组合模式有3种aph(3')-lia、aac(6')-Ⅱc-OXA-10、acc(6')-Ⅰb-OXA-1-catB3，第三种组合方式最常见，占整合子阳性株的43％(6/14)。
　　 3、整合子阳性菌株耐药率与整合子阴性株耐药率的比较，经Chi-squaretest，P＞0.05，没有明显差异，这里表明整合子阳性菌株携带的耐药基因不表达或表达较弱，而使与整合子阴性株的耐药差异无显著性。转化菌载体上自己的启动子较弱，所以转化菌转入的耐药基因不表达，耐药表型为敏感，提示整合子上整合的耐药基因需要适宜的启动子才表达。但是整合子阳性菌携带的耐药基因，却可导致耐药基因的水平及垂直播散。
　　 结论:
　　 1、本地区临床分离的铜绿假单胞菌整体耐药率低。
　　 2、只有Ⅰ类整合子阳性，Ⅰ类整合子携带率13％。整合子可变区共扩增出6种耐药基因，有三种组合方式，未发现新的耐药基因盒。
　　 3、整合子-基因盒系统在铜绿假单胞菌的耐药机制和耐药基因的播散中发挥了一定的作用。

目录

声明

摘要

引言

材料与方法

一、仪器、试剂和耗材

二、标本采集

三、细菌鉴定和药敏试验

四、PCR检测92株临床分离的铜绿假单胞菌的整合子类型及携带的耐药基因

五、整合子阳性株 TA克隆、转化，以及测序

六、整合子可变区在DH5α中的表达

七、统计学分析

结果

一、药敏结果

二、整合子PCR扩增结果

三、整合子阳性株及阴性株耐药性比较

四、染色体可变区测序序列在GENBANK经BLAST比对分析结果

五、整合子可变区在DH5α中的表达

讨论

一、铜绿假单胞菌的耐药情况分析

二、整合子-基因盒阳性率及携带耐药基因情况

三、整合子基因盒与细菌耐药表型的关系

结论

参考文献

综述

致谢