FOXC2及MUC4促进多形性胶质母细胞瘤增殖、迁移与侵袭作用及其分子机制研究

摘要

第一部分、FOXC2促进多形性脑胶质母细胞瘤增殖、迁移与侵袭作用及其机制研究
　　目的:揭示FOXC2(forkhead box C2，叉头框C2)在GBM(Glioblastoma，多形性胶质母细胞瘤)组织及GBM细胞系中的表达情况并利用GBM细胞系构建FOXC2高表达细胞模型与FOXC2基因沉默细胞模型。检测FOXC2对于GBM细胞增殖，迁移及侵袭能力的影响并研究该影响在GBM细胞内的调节机制。
　　方法:利用RT-PCR、Western blot以及免疫组织化学实验测定GBM人脑组织样本、对照人脑组织样本以及六种GBM细胞系中FOXC2的表达情况。根据所得六种GBM细胞系中FOXC2表达结果，进一步通过质粒转染与RNA基因沉默实验构建FOXC2高表达的SNB19-FOXC2细胞模型、FOXC2基因沉默的T98G-shFOXC2细胞模型及EGFR(epidermal growth factor receptor，表皮生长因子)沉默的SNB19-FOXC2-siEGFR细胞模型。应用MTT和细胞克隆形成实验测定上述所构建细胞系中FOXC2表达对SNB19和T98G细胞增殖能力的影响并通过细胞伤口愈合实验和Boyden小室模型测定SNB19-FOXC2细胞与T98G-shFOXC2的迁移及侵袭能力变化。通过RT-PCR、Western blot和免疫组化实验测定FOXC2对EGFR在GBM细胞系中表达量的影响。同时在SNB19-FOXC2细胞中构建EGFR基因沉默模型 SNB19-FOXC2-siEGFR1，2。通过MTT实验，Boyden小室模型实验，细胞伤口愈合实验，研究EGFR对于FOXC2促GBM细胞增殖，迁移以及侵袭能力的调控作用。
　　结果:分别将10份GBM病人大脑样本与10份对照病人大脑样本的RT-PCR和Western blot实验结果比较得出所有GBM病人大脑样本中FOXC2的表达量都明显高于对照病人大脑样本。免疫组化实验结果中也发现GBM病人大脑样本中的FOXC2阳性细胞数也同样高于对照病人脑组织样本。在U87，T98G，SNB19，SW1088，SF767和SW1783六种GBM细胞系中，T98G中FOXC2表达量最高而SNB19中FOXC2的表达量最低。根据此结果，进一步将T98G细胞用于FOXC2基因沉默实验构建T98G-shFOXC2细胞模型，而将SNB19细胞用于FOXC2基因转染实验，构建FOXC2基因高表达SNB19-FOXC2模型。MTT和细胞克隆形成实验结果显示，SNB19-FOXC2细胞相对与对照组SNB19细胞增殖能力大幅提高，克隆形成总数明显增多，克隆形成范围更广。而T98G-shFOXC2细胞相对与对照组T98G细胞克隆形成数目明显减少，克隆形成范围也明显缩小。细胞伤口愈合实验和Boyden小室实验结果显示，SNB19-FOXC2细胞能够显著加快细胞伤口愈合速度并且具有2倍于SNB19细胞穿透Transwell膜的能力。另一方而，FOXC2基因沉默后，T98G-shFOXC2细胞迁移与侵袭的能力显著降低并且T98G-shFOXC2细胞对于细胞伤口愈合的促进作用以及透过Transwell膜的能力都明显小于T98G细胞。RT-PCR及Western blot实验结果显示，FOXC2基因沉默能够明显降低T98G细胞中EGFR在RNA转录和蛋白水平的表达。利用RNA干扰技术，进一步沉默SNB19-FOXC2细胞中EGFR相关基因，构建SNB19-FOXC2-siEGFR细胞模型。MTT实验，Boyden小室模型实验及细胞伤口愈合实验结果显示，SNB19-FOXC2-siEGFR细胞的增殖、迁移与侵袭的能力都较SNB19-FOXC2细胞有大幅的下滑。该结果说明EGFR基因在FOXC2促进GBM细胞的增殖、迁移与侵袭能力的发挥过程中起着重要的调控作用。
　　结论:
　　(1) FOXC2在GBM病人组织样本及GBM细胞系中为显著高表达。
　　(2)FOXC2在GBM细胞增殖、迁移与侵袭过程中起到至关重要的作用。
　　(3) FOXC2调控EGFR在GBM细胞中的表达。
　　(4) EGFR是FOXC2调控GBM细胞增殖、迁移与侵袭的重要调控因子。
　　第二部分、MUC4粘蛋白上调表皮生长因子受体表达及其对多型性胶质母细胞瘤增殖、迁移与侵袭促进作用研究
　　目的:探究MUC4(mucin4，4型粘蛋白)在GBM病人组织与GBM细胞系中表达情况。构建MUC4高表达与MUC4基因沉默细胞模型。揭示MUC4对于GBM细胞增殖、迁移及侵袭活性的影响及其分子机制。
　　方法:通过RT-PCR、免疫组化以及Western blot实验测定对照病人脑组织样品、GBM病人脑组织样品与六种GBM细胞系中MUC4表达量高低。根据六种GBM细胞中MUC4的表达情况进而通过基因转染与RNA干扰实验构建MUC4过表达SNB19-MUC4细胞、MUC4沉默T98G-shMUC4细胞模型及EGFR(epidermal growthfactor receptor，表皮生长因子)沉默SNB19-MUC4-siEGFR细胞模型。利用MTT和细胞克隆形成实验测定MUC4对GBM细胞增殖能力影响。通过伤口愈合实验和Boyden小室模型测定SNB19-MUC4细胞以及T98G-shMUC4细胞的迁移及侵袭能力。通过RT-PCR、Western blot和免疫组化实验测定MUC4对EGFR表达的影响。同时构建EGFR基因沉默SNB19-MUC4-siEGFR1，2，3细胞模型。通过MTT实验，Boyden小室模型实验，细胞愈合实验，研究EGFR沉默后MUC4促GBM细胞增殖，迁移以及侵袭能力的变化情况。
　　结果: RT-PCR实验测定11份对照病人大脑样本与11份GBM病人大脑样本中MUC4的表达发现，11份GBM病人大脑样本中MUC4的表达明显高于对照大脑样本并且在免疫组织化学实验结果中GBM病人大脑样本中的MUC4阳性细胞数也同样明显多于对照样本。利用RT-PCR及Western blot实验测定了六种GBM细胞系中MUC4的表达量，结果显示其中T98G细胞系中MUC4表达量最高而SNB19细胞系中MUC4的表达量最低，进而将T98G细胞用于构建MUC4基因沉默T98G-shMUC4细胞模型而将SNB19细胞用于MUC4基因转染实验构建MUC4基因过表达SNB19-MUC4细胞模型。在细胞增殖实验中，MTT和细胞克隆形成实验结果显示SNB19-MUC4细胞相对于对照组SNB19细胞增殖能力大幅提高，克隆数量更多且克隆范围更广。另一方面，T98G-shMUC细胞相对与照组T98G细胞克隆数量明显下降，范围上也有所缩小。细胞伤口愈合实验证明SNB19-MUC4细胞能够显著加快细胞伤口愈合速度。Boyden小室模型结果显示SNB19-MUC4细胞具有3倍与对照组细胞透过Transwell膜的能力。然而，细胞伤口愈合实验与Boyden小室模型结果说明经MUC4基因沉默后T98G-shMUC4细胞对于伤口愈合的促进作用以及透过Transwell膜的能力都明显小于未沉默组细胞。RT-PCR及Western blot实验结果显示，MUC4基因沉默能够明显降低T98G细胞中EGFR在RNA和蛋白水平的表达。利用RNA干扰技术，进一步将SNB19-MUC4细胞中EGFR相关基因EGFR-1，2，3沉默。MTT实验，Boyden小室模型实验，细胞愈合实验结果显示，SNB19-MUC4细胞的增殖、迁移与侵袭的能力都较沉默前有大幅的下降。说明EGFR基因在MUC4促进GBM细胞的增殖、迁移与侵袭能力的过程中发挥重要的调控作用。
　　结论:
　　(1) MUC4在GBM细胞系中显著表达并且在GBM细胞的增殖、迁移与侵袭过程中发挥重要作用。
　　(2) MUC4能够调控EGFR在GBM细胞中的表达，EGFR对于MUC4促进GBM细胞的增殖、迁移与侵袭能力有重要的影响。