人工合成抗菌肽Pac525对种植体周围炎病原菌抑制作用的研究

摘要

目的:本实验选用前期实验已证实对牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌及血链球菌这三种种植体周围炎病原菌有不同程度抑制作用的人工合成抗菌肽Pac525，通过活菌计数绘制其对这三种菌的kill-time曲线，以期进一步发现其在不同时间、不同药物浓度下Pac525对这三种菌的抑制作用;建立活菌生物膜，扫描电镜观察其生长状况;采用结晶紫法测定Pac525对这三种菌完整生物膜形成的药物最低抑制生物膜浓度(MBIC)和药物最低清除已形成生物膜浓度(MBRC)。
　　方法:
　　1.抗菌肽Pac525对种植体周围炎致病菌的kill-time依据Pac525的氨基酸序列，人工合成该抗菌肽。本实验采用活菌计数法研究Pac525对牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌及血链球菌的kill-time。
　　2.纯钛表面牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌及血链球菌的菌斑生物膜的建立。
　　为模拟口腔环境，用唾液对光滑钛片预处理（37℃，24小时），使其表面形成获得性膜。将钛片放入24孔板中，PBS冲洗，每孔加入1500μl BHI液体培养基和500μ l菌液，37℃恒温培养24～48小时，脱水干燥，扫描电镜观察其生物膜。
　　3.抗菌肽Pac525对种植体周围炎致病菌菌斑生物膜的影响MBIC的测定:在96孔板上分别建立三种菌的生物膜，加入200μl Pac525药液培养基和20μl1×107cfu/ml菌液，37℃恒温培养24～48小时，PBS冲洗，甲醛固定，结晶紫染色，无菌去离子水冲洗，乙醇复吸，酶标仪测定吸光度。根据公式计算其MBIC。使用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。
　　MBRC的测定:在96孔板上加入200μ lBHI液体培养基和20μl1×107CFU/ml菌液37℃恒温培养24～48小时，吸出上清和浮游菌，PBS冲洗，加入200μl Pac525药液培养基24～48小时，吸出上清和浮游菌，PBS冲洗，甲醛固定，结晶紫染色，无菌去离子水冲洗，乙醇复吸，酶标仪测定吸光度。根据公式计算其MBRC。使用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。
　　结果:
　　1.抗菌肽Pac525对种植体周围炎致病菌的kill-time通过kill-time曲线我们可以看出，随着时间的改变，不同浓度的Pac525均显示出了一定程度的抑菌及杀菌功效。对于血链球菌，0.5h不同浓度的Pac525即显示出不同程度的抑菌作用，其中2MIC（minimum inhibitory concentration，最小抑菌浓度）和4MIC尤为明显，1h时4MIC已杀死全部血链球菌，3.5h时MIC的杀菌作用趋于平稳，1h2MIC杀菌作用趋于平稳，均保持在较高水平。对于具核梭杆菌，4h时不同浓度的Pac525即显示出不同程度的抑菌作用，8h时2MIC已杀死全部具核梭杆菌，此时MIC的杀菌作用也趋于稳定。对于牙龈卟啉单胞菌，4h时2MIC已杀死全部牙龈卟啉单胞菌，8h时MIC也已杀死全部牙龈卟啉单胞菌。结果表明Pac525对菌的杀死作用随药物的浓度和时间呈正相关。通过kill-time曲线可以得出这种作用趋势。
　　2.抗菌肽Pac525对种植体周围炎致病菌菌斑生物膜作用结果经单因素方差分析(P＜0.05) PAC525对血链球菌MBIC50为1 mg/ml，为其MIC的8倍。PAC525对具核梭杆菌MBIC50为0.125 mg/ml，为其MIC的16倍。PAC525对牙龈卟啉单胞菌MBIC500.5 mg/ml，为其MIC的8倍。但是MBRC并未测出来。
　　结论:
　　1.抗菌肽Pac525对种植体周围炎致病菌牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌及血链球菌的抑菌作用随时间和药物的浓度呈正相关改变。
　　2.抗菌肽Pac525对三种细菌的菌斑生物膜均有破坏作用。MBIC为MIC的8～16倍。
　　3.MBRC50并未测出，这极有可能与其早期抑菌有关。