原花青素B1通过TLR4/MD2抑制LPS介导的炎症反应

摘要

目的:脂多糖为革兰氏阴性细菌最主要的致病物质，又称内毒素，其诱发的一系列机体炎症细胞参与的炎性介质释放链级炎症反应，对人体组织造成损伤，甚至引发脓毒症导致全身多器官功能不全，危机生命。固有免疫细胞通过Toll样受体(TLRs)对内毒素进行识别，比如单核细胞、巨噬细胞等表面的TLR4在结合LPS以后即被激活，通过一系列胞内信号传导，释放出以肿瘤坏死因子α(TNF-α)为代表的前炎症因子。TLR4与LPS并非直接结合，与前者同时表达的髓样分化蛋白2（MD-2）介于两者之间，而且MD-2内部具有LPS的关键毒性成分——脂质A的结合位点。TLR4下游接头分子是髓样细胞分化因子88(MyD88)，介导非常重要的MyD88依赖性TLR4信号传导通路，即包括了NF-κB及MAPK两条路径，该通路的激活导致了前炎症因子释放，如IL-1β、TNF-α。原花青素(Procyanidin)是一种富含多酚类的化合物，在抗炎免疫方面，其被发现能够减低前炎症因子的分泌。但是原花青素的抗炎机制目前还不完全清楚，有研究显示在体外细胞炎症模型中，原花青素对LPS介导的炎症反应的减轻作用与其对NF-κB及MAPK两条信号通路的抑制有关。为了进一步探明原花青素与上游TLR4/MD2复合受体的关系，本研究以完全表达TLR4的人单核细胞系（THP-1）细胞为模型，观察原花青素B1对LPS介导的炎症细胞TLR4/MD2下游关键接头分子MyD88以及MD-2的转录水平的影响。
　　方法:人急性单核细胞白血病细胞系THP-1在37℃、5％CO2条件下，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基传代培养，细胞密度维持在5～10×105个/ml。药物实验期间所用细胞均处于对数生长期。采用CCK-8法测药物的细胞毒性，将THP-1细胞接种于96孔板中，细胞孵箱预培养，加入不同浓度的原花青素B110μl（终浓度为50～200μg/ml），加入10μL的CCK-8试剂孵育培养后溶液测光吸收值(0D)，并且以得到的安全的原花青素B1浓度范围进行后续实验。采用LPS诱导的THP-1细胞株建立细胞炎症反应模型，以ELISA法测TNF-α的释放含量，THP-1细胞接种于96孔板，孵箱预培养24h，之后以LPS(1μg/ml)加或不加原花青素B1(100μg/ml、50μg/ml)刺激THP-1细胞，培养18h，分别收集各组细胞悬液离心后上清液体，与配置好的标准品一起行ELISA检测，以标准品的光吸收值(0D)建立标准曲线，进而得到各实验组TNF-α的释放量水平。沿用LPS诱导的THP-1细胞株建立细胞炎症反应模型，借助实时定量PCR法分析MyD88mRNA以及MD-2mRNA转录水平的变化，设计合成人MyD88的基因序列、人MD-2的基因序列及内参人甘油醛脱氢酶GAPDH的基因序列的引物，THP-1细胞接种于6孔板中，孵箱预培养24h，以LPS(1μg/ml)加或不加原花青素B1刺激THP-1细胞，培养18h。提取各实验组细胞总RNA，之后反转录成cDNA与引物进行目的基因扩增，计算MyD88mRNA及MD-2mRNA相对定量。
　　结果:CCK-8测试药物毒性的实验中，原花青素B1浓度不大于100μg/ml的情况下THP-1细胞活力几乎不受影响，而当原花青素B1浓度在150μg/ml200μg/ml的情况下，THP-1细胞活力均受到损害。ELISA检测TNF-α释放量实验中，对于阴性对照组，LPS单独刺激组的TNF-α分泌水平明显升高，表明经过LPS的刺激，THP-1细胞做出免疫反应，经过一系列胞内信号传导，最终释放出前炎症因子。原花青素B1干扰组和LPS单独刺激组相比，其肿瘤坏死因子释放水平明显降低，且具有统计学差异。另外，由于原花青素B1干扰的剂量差异，原花青素B1100μg/ml组较原花青素B150μg/ml组所释放的肿瘤坏死因子α水平更低，且这种差异同样具有统计学意义。Real-time PCR检测目的基因的实验中，和阴性对照组相比，LPS刺激组MyD88mRNA及MD-2mRNA相对量显著提高，提示LPS可以显著上调THP-1细胞的MyD88mRNA及MD-2mRNA表达。而原花青素B1干扰组MyD88mRNA及MD-2mRNA相对量较LPS组显著下降，且差异具有统计学意义，提示原花青素B1对LPS介导的MyD88mRNA及MD-2mRNA表达上调具有抑制作用。
　　结论:原花青素B1对于THP-1细胞具有毒性，而当原花青素B1的浓度在100ug/ml及以下时，细胞活力不受损害。原花青素B1可明显降低LPS诱导下THP-1细胞肿瘤坏死因子α的释放，并且呈浓度依赖性。原花青素B1这种作用可能其抑制THP-1细胞炎症反应时MyD88mRNA及MD-2mRNA表达上调有关，提示原花青素可能是一种潜在的TLR4/MD2复合受体拮抗剂。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

1．原花青素B1的制备

2．细胞培养

3．CCK-8法测药物的细胞毒性

4．ELISA法测TNF-α的含量

5．实时定量PCR法测MyD88mRNA以及MD-2mRNA的转录水平

6．统计学方法

结果

1．原花青素B1对THP-1细胞的毒性

2．原花青素B1对LPS诱导下THP-1细胞释放TNF-α的影响

3．原花青素B1对LPS刺激下THP-1细胞MyD88mRNA以及MD-2mRNA转录水平的影响

讨论

结论

参考文献

综述 大黄及其活性成分的抗炎机制研究进展

致谢