人源抗TLR4抗体Fab片段抑制内毒素(LPS)引起的炎症反应的体外及体内研究

摘要

Toll样受体4（TLR4）是Toll受体家族中发现最早并研究最深的模式识别受体，在先天免疫中扮演重要的角色。TLR4主要识别内毒素（LPS），激活其信号通路，引起急性炎症、败血症、慢性感染性疾病等。TLR4是内毒素发挥生物学效应的瓶颈和内毒素瀑布效应的限速步骤，是整个内毒素信号转导通路的枢纽，阻断TLR4对内毒素信号的传导，是控制内毒素生物效应的最为有效的手段。因此，研究与开发治疗性抗TLR4基因工程抗体，应用于G-细菌感染性疾病和感染性休克的治疗，有望能够迅速阻断病情发展、挽救患者的生命。在我们前期研究中，利用嵌合抗体技术，针对人源抗TLR4抗体设计合成抗TLR4抗体Fab片段，利用重叠延伸法扩增Fab片段基因，成功的构建了质粒，表达出抗TLR4抗体Fab片段，并命名为 hTLR4-Fab04。在本研究中，我们主要通过建立细不同种系细胞及动物炎症模型，在体内外验证抗TLR4抗体Fab片段对LPS引起的炎症反应的抑制情况。
　　研究方法
　　1.分析 hTLR4-Fab04是否结合小鼠巨噬细胞表面 TLR4分子，探讨hTLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后，Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在mRNA和蛋白水平的表达改变情况，观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。
　　2.分析 hTLR4-Fab04是否结合小鼠树突状细胞表面 TLR4分子，探讨hTLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后，Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在mRNA和蛋白水平的表达改变情况，观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。
　　3.分析hTLR4-Fab04是否结合人外周血PBMC来源的巨噬细胞表面TLR4分子，探讨hTLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后，Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在mRNA和蛋白水平的表达改变情况，观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。
　　4.分析hTLR4-Fab04是否结合人外周血PBMC来源的树突状细胞表面TLR4分子，探讨hTLR4-Fab04阻断LPS引起的TLR4信号通路活化后，Q-PCR和ELISA检测相关炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β在mRNA和蛋白水平的表达改变情况，观察TLR4相关信号通路MAPKs、NF-κB和IRF-3等的磷酸化水平改变情况。
　　5.利用小鼠内毒素休克模型观察 hTLR4-Fab04在体内炎症反应的抑制情况。将hTLR4-Fab04和对照抗体腹腔注射C57BL/6J小鼠，观察hTLR4-Fab04对内毒素休克小鼠血清细胞因子的变化情况。
　　研究结果
　　1. hTLR4-Fab04与人外周血来源的巨噬细胞及DCs表面TLR4分子结合率高达90％，与鼠源巨噬细胞及DCs表面TLR4分子结合率达到60％左右。
　　2.在LPS诱导的四种细胞炎症模型中，hTLR4-Fab04均可从mRNA水平和蛋白水平抑制炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β）的表达。抑制效率都可以达到50％左右。
　　3.在LPS诱导的四种细胞炎症模型中，hTLR4-Fab04对TLR4信号通路下游的 MAPKs（JNK、ERK、p38）、NF-κB(IKK、IκB、p65)和 IRF-3磷酸化水平均有不同程度的抑制。
　　4.在动物细胞模型中，不同浓度的hTLR4-Fab04均显示出对小鼠血清中炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1和IFN-β）有一定的抑制效果，当hTLR4-Fab04浓度为2mg/kg时，对四种炎症因子抑制效率最佳，抑制率均可达50％左右。
　　结论
　　本研究验证了hTLR4-Fab04可以与不同来源的细胞表面TLR4分子结合。在体外和体内实验中，hTLR4-Fab04均显示出对内毒素（LPS）引起的炎症反应有抑制效果。本研究为hTLR4-FTLR4在临床实验中提供了实验基础。同时，也为治疗SIRS等内毒素感染引起的疾病提供了一种新的方法。

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1.前言

2.实验材料

2.1 主要试剂与材料

2.2 主要仪器

2.3 常用溶液配制

3. 实验方法

3.1 细胞分离与培养

3.2 体外实验

3.3 体内实验

4. 实验结果

4.1 hTLR4-Fab04可与不同种系细胞表面TLR4分子结合

4.2 hTLR4-Fab04抑制炎症因子mRNA水平的表达

4.3 hTLR4-Fab04抑制炎症因子蛋白水平的表达

4.4 hTLR4-Fab04抑制TLR4信号通路磷酸化水平

4.5 hTLR4-Fab04抑制小鼠血清中炎症因子释放

5.讨论

6．结论

参考文献

8.附录 综述:TLR4信号通路研究进展

本人简历

研究成果

致谢