6-姜酚对过氧化氢致HUVEC损伤的保护作用及机制探讨

摘要

本文主要从以下几部分展开论述:
　　第一部分 6-姜酚通过自噬对过氧化氢致HUVEC凋亡的保护作用
　　目的:动脉粥样硬化的发生和发展是一种多因素参与的复杂病理生理学过程。凋亡是诱发心血管细胞损伤的重要原因之一，多种可以引起动脉粥样硬化的致病因素均可激活血管内皮细胞发生凋亡。在近期的研究中，关于自噬与凋亡在心脏疾病中的相互关系，以及自噬所起的调节作用受到很大关注。自噬在心血管功能及形态的维持中起着非常重要的作用，研究自噬在血管内皮细胞损伤中的作用，可以为动脉粥样硬化治疗提供新思路。很多植物化学物可以诱导自噬的发生，6-姜酚作为一种植物化学物具有抗动脉粥样硬化的作用，但具体的机制尚不完全清楚，本研究着重探讨自噬是否在6-姜酚抗动脉粥样硬化过程中发挥重要作用。
　　方法:以人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)为研究对象，应用不同浓度的6-姜酚(10-40μM)预处理24小时后，再与H2O2(800μM)共同作用1小时。用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测不同剂量的6-姜酚和H2O2作用后，HUVEC存活率的变化，同时应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin)预处理，检测6-姜酚和H2O2作用后，HUVEC存活率的变化;用Hoechst33342荧光染色和annexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡;用荧光显微镜观察经过Cyto-ID(R) Green染色的自噬体的变化;用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测细胞内自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ，自噬相关蛋白Bcl-2、Beclin-1、mTOR、p-mTOR表达量的变化;用激光共聚焦显微镜观察HUVEC溶酶体稳定性的变化;用荧光分光光度计检测细胞内活性氧类(ROS)的含量变化，还原性谷胱甘肽(GSH)水平的改变，线粒体膜电位的变化，同时应用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂雷帕霉素预处理，检测6-姜酚和H2O2作用后，HUVEC内ROS和GSH水平的变化。
　　结果:(1)凋亡的结果:H2O2(800μM)作用1小时后，应用Hoechst33342染色，荧光显微镜下可见胞核浓染，浓缩或碎裂的凋亡细胞。用6-姜酚(10-40μM)预处理后，镜下可见凋亡细胞数明显下降，荧光分布区域减少，呈明显的量效关系;annexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞仪检测HUVEC凋亡的结果表明:与对照组相比，H2O2处理组凋亡细胞明显的增多(P＜0.01)，经6-姜酚保护后，各剂量组的细胞凋亡的数目明显减少，并呈明确的量效关系(P＜0.01)。(2)自噬的结果:经过Cyto-ID(R)Green染色后，荧光显微镜观察对照组和H2O2处理组绿色点状荧光较少，而6-姜酚保护组中，自噬体所发出明亮绿色荧光物质逐渐增多;Western blot结果显示自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ表达随6-姜酚浓度增加而增加，呈明显的量效关系(P＜0.01);(3)自噬相关蛋白表达的结果:Western blot结果显示对照组与H2O2处理组未见到明显的Bcl-2，Beclin-1，及p-mTOR蛋白的表达。而6-姜酚保护组中，随6-姜酚浓度增加，Bcl-2,Beclin-1蛋白的表达量逐渐增加，而p-mTOR蛋白表达逐渐减少(P＜0.01)。(4)氧化应激指标结果:荧光分光光度计检测结果显示H2O2处理组中ROS水平显著上升，与对照组相比有显著性差异(P＜0.01)，而6-姜酚保护组巾，随6-姜酚浓度增加，ROS水平显著降低(P＜0.05或P＜0.01);H2O2处理组中GSH水平显著下降(P＜0.01)，而6-姜酚保护组中，随6-姜酚浓度增加，GSH水平显著提高（P＜0.05或P＜0.01）。应用自噬抑制剂3-MA预处理后，ROS水平显著升高，GSH水平显著降低，与未加3-MA组比较，其差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);加入雷帕霉素(100nmol/L)预处理后，细胞内的ROS水平显著降低，GSH水平显著升高，与未加雷帕霉素组比较，其差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。(5)溶酶体线粒体结果:荧光分光光度计检测结果显示H2O2处理后，线粒体膜电位水平显著下降(P＜0.01)，用6-姜酚预处理后，可升高HUVEC线粒体的膜电位水平(P＜0.05或P＜0.01);激光共聚焦显微镜结果显示，H2O2处理组，AO荧光强度较弱(P＜0.01)，提示细胞溶酶体稳定性降低，而对照组和6-姜酚预处理组，AO荧光强度较强，提示6-姜酚可以提高细胞溶酶体的稳定性(P＜0.05或P＜0.01)。
　　结论:1、H2O2(800μM)作用于HUVEC1小时后可引起细胞发生凋亡，6-姜酚(10-40μM)预处理24小时后可抑制凋亡的发生。2、6-姜酚作用于HUVEC可引起细胞自噬的发生。3、自噬相关蛋白Bcl-2，Beclm-1蛋白表达增加，p-mTOR蛋白表达减少，提示自噬的发生可能与mTOR信号通路和Beclin1复合物有关。4、氧化应激的结果显示，H2O2处理后，ROS水平升高，GSH水平下降，6-姜酚预处理后可降低ROS水平，升高GSH水平，推测自噬有潜在的抗氧化应激的作用。5、6-姜酚作用后可使HUVEC溶酶体稳定性增加，线粒体的膜电位水平升高，从而抑制凋亡的发生。
　　第二部分 6-姜酚对过氧化氢致人脐静脉内皮细胞DNA损伤的保护作用
　　目的:冠心病的发病机制涉及多种因素，其中血管内皮细胞损伤是心血管疾病发生的始动因素。大量实验证明血管内皮细胞DNA损伤与动脉粥样硬化密切相关，活性氧是导致DNA损伤的直接原因之一，当活性氧的产生与细胞抗氧化能力失衡时就会造成氧化应激(oxidative stress)，引起活性氧增加，通过复杂机制导致DNA损伤。本研究的目的是检测6-姜酚作为一种抗氧化剂，能否保护过氧化氢致HUVEC的DNA损伤，并探讨其可能的机制。
　　方法:以人脐静脉内皮细胞HUVEC为研究对象，用H2O2作为诱导剂，建立DNA损伤模型。应用不同浓度的6-姜酚(10-40μM)预处理24小时后，再与H2O2(50μM)共同作用1小时。用单细胞凝胶电泳（彗星实验）检测细胞DNA损伤情况;用荧光分光光度计检测细胞内ROS的含量变化，GSH水平的改变，线粒体膜电位的变化，溶酶体膜稳定性的改变;用Western blot法检测细胞内p53蛋白的表达量的变化。所用试验应用N-乙酰半胱氨酸(NAC，10 mM)作为阳性对照。
　　结果:(1) DNA损伤结果:H2O2(50μM)作用于HUVEC1小时后，引起DNA链断裂，细胞形成彗星样拖尾现象，尾长、尾部DNA/头部DNA(％)及尾矩明显大于对照组(P＜0.01)。用6-姜酚(10，20，40μM)处理HUVEC24小时，然后与H2O2组温育1小时，SCGE试验各项指标明显减轻(P＜0.05或P＜0.01)。(2)氧化应激指标结果:用2'，7'-二氢二氯荧光素(DCFH)和苯二醛(OPT)分别测定细胞内ROS以及GSH水平，结果显示，H2O2作用于HUVEC1小时后，细胞内ROS水平显著上升，GSH水平显著下降，用6-姜酚预处理后，可显著降低细胞内ROS水平，显著升高GSH水平。与对照组相比有统计学意义，并呈明显的量效关系(P＜0.05或P＜0.01)。(3)溶酶体线粒体结果:H2O2(50μM)作用于HUVEC1小时，细胞内溶酶体膜的稳定性显著降低(P＜0.01）。HUVEC经6-姜酚预处理24小时后，再与H2O2温育1小时，细胞内溶酶体膜的稳定性显著高于H2O2组(P＜0.05或P＜0.01)。将H2O2(50μM)作用于HUVEC1小时，细胞内线粒体膜电位显著降低(P＜0.01)。经10μM-40μM浓度的6-姜酚处理24小时后，再与H2O2作用1小时，可见细胞内荧光强度明显增高，细胞内线粒体膜电位升高，并呈剂量依赖关系(P＜0.05或P＜0.01)。(4) p53蛋白表达的结果:Western blot结果显示H2O2(50μM)组p53蛋白表达明显，与对照组相比有显著性差异(P＜0.01)。6-姜酚(40μM)预处理24小时后，再与H2O2共同作用1小时，细胞内p53蛋白表达水平明显下降，与单独H2O2组相比有显著性差异（P＜0.01）。NAC阳性对照组，p53蛋白表达水平较低，与单独H2O2组相比有显著性差异(P＜0.01)。
　　结论:1、H2O2(50μM)作用于HUVEC1小时后可引起细胞发生DNA损伤，6-姜酚(10-40μM)预处理24小时后可抑制DNA损伤的发生。2、H2O2(50μM)可引起HUVEC内ROS生成增加，细胞内抗氧化物质GSH耗竭，使细胞处于氧化应激状态，6-姜酚可减少H2O2引起HUVEC内ROS水平的升高，并使H2O2造成的GSH下降有所回升。3、推测溶酶体和线粒体可能是H2O2引起HUVEC的DNA损伤的主要靶器官。4、H2O2可能通过p53通路造成细胞的DNA损伤，6-姜酚可通过降低p53蛋白的表达来降低HUVEC的DNA损伤程度。

目录

声明

摘要

(一)前言

第一部分 6-姜酚通过自噬对过氧化氢致HUVEC凋亡的保护作用

(二)材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

(三)结果

1．6-姜酚，H2O2及自噬诱导剂和抑制剂对HUVEC存活率的影响

2．Hoechst 33342荧光染色方法观察凋亡的结果

3．Annexin V-FITC／PI双染流式细胞仪检测印HUVEC的凋亡

4．荧光显微镜观察HUVEC的自噬体结果

5． 6-姜酚及H2O2对HUVEC蛋白表达的影响

6．激光共聚焦显微镜观察HUVEC溶酶体稳定性

7．6-姜酚及H2O2对HUVEC内线粒体膜电位水平的影响

8．6-姜酚及H2O2对HUVEC内ROS水平的影响

9．6-姜酚及H2O2对HUVEC内GSH水平的影响

(四)讨论

(五)结论

参考文献

第二部分 6-姜酚对过氧化氢致人脐静脉内皮细胞DNA损伤的保护作用

(二)材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

(三)结果

1．6-姜酚对H2O2所致HUVEC的DNA链断裂的影响

2．6-姜酚对H2O2作用于HUVEC产生ROS的影响

3．6-姜酚对H2O2作用于HUVEC产生GSH的影响

4．6-姜酚对H2O2作用于HUVEC后溶酶体膜稳定性的影响

5．6-姜酚对H2O2作用于HUVEC后线粒体膜电位的影响

6．6-姜酚对H2O2作用于HUVEC后p53蛋白表达的影响

(四)讨论

(五)结论

参考文献

三、综述 自噬在心血管病中作用的研究进展

攻读博士学位期间发表和待发表论文情况

致谢