CXCR1/2拮抗剂G31P联合GDCO941对乳腺癌治疗的增强作用

摘要

目的:趋化因子是一种主要由免疫细胞、某些基质细胞和肿瘤细胞等多种细胞分泌的可结合在内皮细胞表面、对中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等不同细胞具有趋化和激活作用的细胞因子。CXC趋化因子在炎症反应、血管形成过程和肿瘤微环境中发挥重要作用，CXCR1/2通过与配体的结合，激活胞内下游信号通路，除了趋化、活化免疫细胞外，也在肿瘤的发生、发展、转移，病原微生物感染以及移植排斥反应等病理过程中发挥作用。有研究发现IL-8在多种肿瘤细胞中过表达，促进肿瘤的血管生成、侵袭和转移等。G31P是我实验室通过点突变法人工构建得到的对受体CXCR1/2亲和力高于CXCL-8，但无生物学趋化活性的CXCL-8衍生物，竞争性抑制包括IL-8在内的多种趋化因子与CXCR1/2的结合，G31P通过阻断CXCL-8等细胞因子的生物学作用抑制血管生成，从而影响肿瘤的生长、转移，进而发挥抗肿瘤作用。GDC-0941是一种口服、有效且特异性的PI3K/Akt/mTOR选择性抑制剂，能够抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡和抑制中心母细胞数。目前处于临床试验阶段，具有疗效好、毒副作用低、患者耐受性好等优点。本实验通过GDC-0941与G31P的联合用药，研究联合用药对人乳腺癌细胞的抑制作用，为肿瘤的临床治疗提供新的思路。
　　方法:体外实验:HCC1954、BT474和4T1细胞体外培养，分组加药处理。检测方法:细胞划痕实验，检测联合应用GDC-0941和G31P对肿瘤细胞迁移能力的影响;蛋白质印迹法，检测联合用药对肿瘤细胞中cl-PARP、bcl-2和pS6蛋白的表达情况;克隆形成实验，检测联合用药对肿瘤细胞成瘤以及增殖能力的影响;细胞活性实验，检测联合用药对肿瘤细胞存活能力的影响;细胞侵袭实验，检测联合用药对于肿瘤细胞侵袭能力的影响;细胞周期检测，检测联合用药对细胞周期分布的影响。体内实验:动物模型建立:BALB/C雌性小鼠背部三处乳垫接种接种5×104个4T1细胞，于接种肿瘤第10天，小鼠随机分为4组，包括GDC-0941+G31P组、GDC-0941组、G31P组和肿瘤对照(Control)组，每组8只。GDC-0941+G31P组小鼠和G31P组小鼠隔天腹腔注射G31P500μg/kg，其余各组同时注射等量生理盐水。GDC-0941组和GDC-0941+G31P组小鼠每日灌胃给药GDC-0941，130mg/kg，其余各组灌胃等量生理盐水。标本处理:用药第24天，小鼠全部处死，剥离实体肿瘤和肺组织。肺组织经固定处理后进行病理学检测。
　　结果:(1)体外实验:细胞划痕实验，GDC-0941+G31P组划痕“愈合”程度显著低于其余三组，提示联合用药能抑制肿瘤细胞的迁移能力;蛋白质印迹法，结果显示GDC-0941+G31P组cl-PARP蛋白表达较其余三组显著增加、bcl-2和pS6蛋白表达较其余三组显著降低，提示联合用药能促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤增殖;克隆形成实验，结果显示GDC-0941组、G31P组、GDC-0941+G31P组克隆形成数与对照组相比都有不同程度减少，GDC-0941+G31P组克隆形成数目最少(p＜0.01)，提示联合用药能增强GDC-0941单药对肿瘤细胞克隆形成的抑制作用;细胞活性实验，结果显示，与对照组比较GDC-0941组存活细胞数量减少，G31P组无统计学差异，GDC-0941+G31P组存活细胞数显著减少(p＜0.05)，提示联合用药能显著增强GDC-0941对肿瘤细胞的杀伤作用;细胞侵袭实验，结果显示，与对照组相比GDC-0941组、G31P组和GDC-0941+G31P组结晶紫染色细胞数均有不同程度减少，其中GDC-0941+G31P组细胞数最少(p＜0.01)，提示联合用药显著抑制肿瘤细胞的侵袭能力;细胞周期检测，结果显示GDC-0941组和G31P组的细胞周期分布与对照组无显著差异，GDC-0941+G31P组S期细胞数明显增多(p＜0.05)，提示联合用药能抑制肿瘤细胞进入G2/M期，抑制细胞增殖。
　　(2)体内实验研究显示，GDC-0941联合G31P可明显抑制肿瘤生长，GDC-0941+G31P组肿瘤平均体积188.4±23.32mm3，明显小于肿瘤组（685.6±109.5）(p＜0.01)，小于单独应用GDC-0941组（461.2±50.70mm3）(p＜0.01)和单独应用G31P组（496±46.75mm3）(p＜0.01)，提示联合用药能显著抑制小鼠乳腺癌实体瘤体积的增长;肺部转移瘤数量以及HE染色显示，联合用药能有效抑制小鼠乳腺癌向肺部转移;小鼠体重显示四组之间无显著差异，提示联合用药的毒副作用可耐受。
　　结论:(1)GDC-0941联合应用G31P能明显抑制小鼠乳腺癌细胞的生长，效果强于单独应用GDC-0941和G31P。
　　(2)GDC-0941联合应用G31P生物学毒性可耐受，相比单独应用GDC-0941和G31P毒副作用无明显增加。
　　(3)GDC-0941联合应用G31P有效抑制乳腺癌的转移，效果强于单独应用两种药物，提高小鼠生存率和生命质量。
　　(4)GDC-0941联合应用G31P，相较于单独应用两种药物，更有效的抑制了肿瘤细胞在体外的发生发展、增殖、转移、侵袭的能力，促进了肿瘤细胞的凋亡和杀伤作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

1．1 试剂和材料

1．2 试验设备和仪器

1．3 细胞株

1．4 动物

2 方法

2．1 划痕实验

2．2 蛋白质印迹法

2．3 克隆形成实验

2．4 细胞活性实验

2．5 细胞侵袭实验

2．6 细胞周期检测

2．7 动物处理及分组

2．8 标本处理方法

3．统计学分析

结果

(一)GDC-0941联合G31P对小鼠乳腺癌细胞的抑制作用

1 小鼠乳腺癌实体瘤体积的比较

2 小鼠乳腺癌肺转移情况比较

3 药物生物学毒性比较

(二)GDC-0941联合G31P对人乳腺癌细胞的抑制作用

1 细胞划痕实验检测肿瘤细胞的迁移能力的改变

2 肿瘤细胞存活实验检测肿瘤细胞存活能力

3 克隆形成实验检测GDC-0941联合应用G31P对肿瘤形成的影响

4 侵袭小室实验检测药物联合应用对肿瘤细胞侵袭能力的抑制作用

5 细胞周期检测联合用药后肿瘤细胞周期分布

6 免疫印迹法检测肿瘤细胞Bcl-2、c1-Parp和pS6的表达

讨论

结论

参考文献

综述 白细胞介素8与乳腺癌的关系以及研究进展

致谢