人参皂甙Rh2诱导小鼠黑色素瘤B16细胞自噬及其机制

摘要

目的:恶性黑色素瘤的发病率仅占皮肤癌的5％左右，但其恶性程度高，转移快，且对放疗和化疗均不敏感，所以预后极差，治疗较为棘手。因此，研制一种提取自天然植物的且具有高敏感性的药物来治疗恶性黑色素瘤是各国学者努力的主要方向。近年来，提取自天然红参根部的原人参二醇型低糖链皂甙单体-人参皂甙Rh2受到了学者们的广泛关注。其抗肿瘤作用已经得到众多国内外学者的认同，但对其抗肿瘤机制的研究尚未完全研究透彻，如关于人参皂甙Rh2是否能够诱导恶性黑色素瘤细胞发生自噬这一研究领域尚未见报道。因此，本文以小鼠恶性黑色素瘤B16细胞为研究对象，通过检测自噬标志性蛋白-Beclin1和LC3来验证人参皂甙Rh2是否参与诱导恶性黑色素瘤细胞发生自噬，同时探讨人参皂甙Rh2是否是通过自噬经典细胞信号转导通路PI3K/Akt/mTOR来调控B16细胞的自噬。
　　方法:1.采用MTT的方法分别检测经过人参皂甙Rh2干预24h、48h和72h后，B16细胞的OD值有何变化，并以此为基础绘制其细胞增殖曲线图，从而分别算取24h、48h和72h三个时间段中，人参皂甙Rh2对B16细胞的半数抑制浓度(IC50)。2.以透射电镜观察以人参皂甙Rh2和自噬抑制剂处理B16细胞后，其生理状态是否改变，主要是自噬小体数量的增减。3.分别提取人参皂甙Rh2干预前、后B16细胞的总蛋白，并以Western blot方法检测其自噬死亡标志性蛋白-Beclin1表达的变化，同时，也检测经人参皂甙Rh2干预后，B16细胞的自噬经典调控信号通路PI3K/Akt/mTOR中的主要效应分子Akt及mTOR活化水平的变化情况，并用Akt的抑制剂-鱼藤素(Deguelin)和mTOR的抑制剂-雷帕霉素（Rapamycin）来反向验证PI3K/Akt/mTOR细胞信号转导通路为B16细胞的自噬调控机制之一。4.通过注射接种肿瘤的方式来建立小鼠的黑色素瘤模型，并通过动物体内实验（免疫组化检测Beclin1和自噬特征蛋白LC3基因的表达）证实人参皂甙Rh2能够诱导B16小鼠黑色素瘤细胞产生自噬，并且安全较高，副作用低。
　　结果:1.MTT检测后，绘制的细胞增殖曲线结果表明，人参皂甙Rh2可以抑制B16细胞生长，且存在浓度和时间依赖性。其中48h的半数抑制浓度(IC50)约为59.87±3.75μg/ml。2.经过人参皂甙Rh2干预后的B16细胞与对照组细胞相比，细胞内自噬小体明显增多。3.Westem blot结果显示，人参皂甙Rh2干预后的B16细胞，自噬死亡标志性蛋白Beclin1的表达较对照组升高明显，而Akt和mTOR的活性均明显降低。Akt抑制剂-鱼藤素(Deguelin)处理组和鱼藤素-人参皂甙组两组的Beclin1蛋白表达水平均高于对照组，但单独鱼藤素组增高程度低于鱼藤素+人参皂甙组，而Akt、mTOR活性降低。同样的，mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）处理组和雷帕霉素-人参皂甙处理组两组的Beclin1蛋白表达水平较野生对照组增高，而mTOR活性降低。4.免疫组化结果证明，经人参皂甙Rh2干预后的小鼠，无论是接种肿瘤前给予药物，还是注射肿瘤后再给予药物，其肿瘤组织切片中的Beclin1蛋白与自噬标志性蛋白-LC3的表达水平均明显高于未经人参皂甙Eh2干预的接种肿瘤的小鼠。5.动物模型血常规、生化结果显示，患有恶性黑色素瘤的小鼠，其白细胞有小幅上升，而中性粒细胞百分比上升明显。相对的，它们的淋巴细胞百分比、红细胞、血红蛋白以及血小板则明显下降，且谷丙和谷草转氨酶均明显升高。经人参皂甙Rh2干预后，以上异常情况均得到相对改善。
　　结论:在人参皂甙Rh2的干预下，B16细胞自噬标志性蛋白LC3和Beclin1明显升高，因此人参皂甙Rh2可能通过诱导B16细胞产生自噬而达到其抑制肿瘤的作用。并且，其有可能是通过P13K/Akt/mTOR信号通路诱导B16细胞自噬。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1．材料

2．实验方法

3．统计学数据处理

结果

1．人参皂甙Rh2对B16细胞的抑制作用

2．人参皂甙Rh2对B16细胞形态变化的影响

3．人参皂甙Rh2对B16细胞Beclin1、Akt、mTOR蛋白表达水平的影响

4．人参皂甙对B16细胞信号通路的影响

5．免疫组化染色结果

6．动物体内实验血常规结果

7．动物体内实验生化结果

讨论

结论

参考文献

综述 自噬与PI3K／Akt／mTOR信号通路的研究进展

致谢