桥粒相关蛋白pinin在肝细胞肝癌发生发展中的作用及分子机制的研究

摘要

原发性肝癌是恶性度极高、预后极差、严重威胁国人生命健康的恶性肿瘤之一。研究显示全世界范围内原发性肝癌在实质性肿瘤中的发病率排名第五，死亡率排名第三。原发性肝癌包括肝细胞肝癌、胆管细胞癌、肝血管肉瘤和肝母细胞瘤，其中最常见的是肝细胞肝癌，占原发性肝癌的80％以上。肝细胞肝癌与多种危险因素相关，如肝炎病毒、吸烟、黄曲霉污染的食物、酗酒、非酒精性脂肪肝、糖尿病、肥胖等。不同国家地区的主要危险因素各不相同，因此对肝癌的诊断、治疗及预后的判断造成了一定的困难。研究显示近10年内肝癌患者的5年生存率正在逐步提高，但是肝癌切除术后5年内的转移复发率仍高达61.5％。由于我国肝炎及肝硬化的患者人数众多，因此我国肝癌的发病率和死亡率均高于世界平均水平。我国的肝癌患者约占全世界肝癌患者的50％，每年约有23万人死于肝癌。全球每年约有60万人因肝癌死亡，多数肝癌患者治疗效果不佳，在确诊后的一年之内死亡，其主要原因包括确诊时大多数患者已是肝癌晚期、肿瘤耐药、肿瘤复发、侵袭血管及多发肝内转移等。对于那些复发转移的肝癌患者采取的主要治疗措施包括系统性化疗和口服靶向治疗药物，如三氧化二砷和索拉非尼。虽然有研究表明一些关键分子参与调控肝癌细胞的增殖、凋亡、耐药及侵袭转移，但其分子机制仍不清楚。因此阐明关键蛋白参与调控肝癌细胞增殖、凋亡、耐药及侵袭转移的确切分子机制，有利于找出预测肿瘤增殖、耐药的生物标记物，以及有效的治疗靶点，对于肿瘤的早期诊断及有效的干预治疗具有重要的研究价值与临床意义。
　　桥粒是具有中间纤维网络的细胞间连接结构，近年来已证实桥粒主要由多种蛋白分子组成，包括糖蛋白以及斑块相关蛋白，其中糖蛋白包括桥粒芯蛋白(desmoglein，DSG)和桥粒胶蛋白(desmocollin，DSC)，它们均是钙粘蛋白家族的成员，斑块相关蛋白包括桥粒斑蛋白(desmoplakin，DP)、斑珠蛋白(plakoglobin，PG)和斑菲素蛋白(plakophilin，PP)。除此之外，一些辅助蛋白如桥粒钙调结合蛋白和桥粒联结蛋白，也参与桥粒的构成。桥粒相关蛋白可增加细胞间的粘着力以维持组织的完整性，同时，也是参与上皮形态发生、分化的关键调节因子。桥粒连接结构一旦被破坏，将会导致上皮组织起源的各类疾病。在某些特定的情况下，桥粒会发生功能的缺失或结构的改变，使细胞之间的粘附能力下降并发生形态学变化，这一系列的改变与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭转移及肿瘤新生血管的形成息息相关。桥粒相关蛋白pinin是一个分子量为140kDa的磷酸化蛋白质，在细胞中分布广泛，并具备多种功能。pinin首次在细胞间中间纤维汇合处的桥粒结构中被发现，它与其它桥粒相关蛋白的相互作用有助于增加上皮细胞之间的粘附力，并降低细胞的迁移能力。除桥粒结构外，pinin也广泛分布于核斑区，参与mRNA前体的剪切和mRNA的转运。pinin可以通过多种途径调节细胞周期、癌细胞的侵袭转移以及耐药性。研究证实，在上皮起源的肿瘤中如肾癌与肺癌，pinin可以抑制肿瘤的发生发展。研究发现，在一些肿瘤组织或癌细胞系中pinin的表达下调，但pinin是否会影响肝细胞肝癌的发生与发展目前尚不清楚。
　　本研究分别在组织水平与细胞水平检测了pinin在肝细胞肝癌中的表达情况，并利用分子生物学方法验证了pinin对肝癌细胞克隆形成能力、增殖能力、细胞活力及葡萄糖剥夺诱导凋亡的调控作用，并初步探讨了其可能的作用机制，以期找.出预测肿瘤增殖、耐药的生物标记物和有效的治疗靶点。
　　目的:
　　探讨桥粒相关蛋白pinin在肝细胞肝癌发生发展中的调控作用及其可能的分子机制。
　　方法:
　　1.利用实时定量PCR和western blot检测肝癌组织、癌旁组织和正常组织pininmRNA和蛋白表达水平的差异。
　　2.利用免疫组化方法检测组织芯片中肝细胞肝癌患者的癌组织及癌旁组织pinin蛋白表达水平的差异。
　　3.利用实时定量PCR和western blot检测不同的肝癌细胞系及正常肝细胞系pinin mRNA和蛋白表达水平的差异。
　　4.利用细胞计数和EdU方法检测敲低pinin对肝癌细胞增殖能力的影响。
　　5.利用结晶紫染色法检测敲低或过表达pinin对肝癌细胞克隆形成能力的影响。
　　6.CCK8检测葡萄糖剥夺环境中敲低pinin对肝癌细胞活力的影响。
　　7.利用western blot检测葡萄糖剥夺对肝癌细胞pinin表达水平的影响。
　　8.利用流式细胞技术和western blot检测葡萄糖剥夺环境中敲低pinin对肝癌细胞凋亡的影响。
　　9.利用流式细胞技术和western blot检测葡萄糖剥夺环境中过表达pinin对肝癌细胞凋亡的影响。
　　10.Western blot检测葡萄糖剥夺环境中，敲低或过表达pinin对细胞内p-ERK水平的影响。
　　11.p-ERK抑制剂U0126处理后，流式细胞技术检测葡萄糖剥夺环境中过表达pinin对肝癌细胞凋亡的影响。
　　12.p-ERK抑制剂U0126处理后，western blot检测葡萄糖剥夺环境中，过表达pinin对细胞内p-ERK水平的影响。
　　结果:
　　1.实时定量PCR和western blot检测显示8例肝细胞肝癌患者中有6例肝癌组织pininmRNA和蛋白的表达明显高于癌旁组织及正常肝组织。
　　2.30例患者中有25例癌组织中pinin的蛋白表达水平明显高于癌旁组织，且pinin的表达与肿瘤的临床分期相关。
　　3.实时定量PCR和western blot检测显示肝癌细胞中pinin mRNA和蛋白的表达明显高于正常肝细胞。
　　4.细胞计数和EdU检测显示敲低pinin使肝癌细胞的增殖能力下降。
　　5.结晶紫染色显示敲低pinin使肝癌细胞克隆形成能力降低，而过表达pinin使肝癌细胞克隆形成能力升高。
　　6.CCK8检测显示葡萄糖剥夺环境中敲低pinin使肝癌细胞的活力下降。
　　7.Western blot显示葡萄糖剥夺可使肝癌细胞pinin的表达水平升高。
　　8.流式细胞技术和western blot显示葡萄糖剥夺环境中敲低pinin使肝癌细胞凋亡增加。
　　9.流式细胞技术和western blot显示葡萄糖剥夺环境中过表达pinin使肝癌细胞凋亡减少。
　　10.Western blot显示葡萄糖剥夺环境中，敲低pinin可促进肝癌细胞中p-ERK的去磷酸化，而过表达pinin可以抑制肝癌细胞内p-ERK的去磷酸化。
　　11.流式细胞技术显示，p-ERK抑制剂U0126可以抑制葡萄糖剥夺后过表达pinin抑制肝癌细胞凋亡的作用。
　　12.Westernblot显示p-ERK抑制剂U0126可以抑制葡萄糖剥夺后过表达pinin抑制肝癌细胞内p-ERK去磷酸化的作用。
　　结论:
　　1.肝癌组织pinin mRNA和蛋白的表达明显高于癌旁组织及正常肝组织，肝癌细胞中pinin mRNA和蛋白的表达明显高于正常肝细胞，因此pinin可能与肝癌的发生密切相关。
　　2.pinin表达升高增强肝癌细胞的克隆形成能力及肝癌细胞对无糖环境的耐受能力。敲低pinin使细胞活力、增殖能力及克隆形成能力下降，因此pinin对肝细胞肝癌的发展起促进作用。
　　3.pinin通过调控ERK信号通路来影响葡萄糖剥夺诱导肝癌细胞的凋亡。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 桥粒相关蛋白pinin在肝细胞肝癌中的表达

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 桥粒相关蛋白pinin在肝细胞肝癌发生发展过程中的作用

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 桥粒相关蛋白pinin调控葡萄糖剥夺诱导肝癌细胞凋亡的分子机制

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 桥粒相关蛋白的研究进展

攻读学位期间发表论文情况

致谢