GLP-2对小肠淤血再灌注损伤作用的初步研究

摘要

目的：
　　原位肝移植术(Orthotopic Liver Transplantation，OLT)是治疗急、慢性重型肝炎，肝硬化肝功能失代偿等终末期肝病的最有效治疗手段。肝移植后，新型免疫抑制剂的使用减少了移植后排斥反应的发生率，却增加了病人发生感染和癌症的可能。同时，肝移植手术无肝期阻断了门静脉，肠系膜上静脉回流受阻，造成小肠粘膜淤血，开放血流后，淤血小肠血流恢复正常，小肠经历再灌注，上述肝移植过程中不可避免出现的小肠淤血再灌注损伤的病理生理学过程，可导致肠粘膜细胞的凋亡，屏障功能受损，进而导致细菌移位。肝移植术后的肠源性感染易引发全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)甚至原发性移植肝无功能(primary non-function，PNF)及多器官功能障碍综合症(multiple organdysfunction syndyrome，MODS)，是阻碍受体及移植肝存活率提高的重要因素。
　　胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptide2，GLP-2)是具有肠道特异性作用的肠上皮生长因子。研究认为，GLP-2能增强肠道屏障功能，促进正常小肠黏膜生长，促进肠道炎症引起的肠黏膜损伤的修复和愈合，通过抑制细胞凋亡并促进肠上皮细胞增殖减轻小肠缺血/再灌注损伤，促进移植小肠结构和吸收功能的恢复。有关GLP-2对肝移植过程中小肠淤血再灌注损伤作用的相关文章尚未见报道。
　　本实验的目的是通过探讨GLP-2处理的小肠淤血再灌注模型中小肠粘膜及其线粒体的变化，说明GLP-2在减少小肠淤血再灌注损伤中的作用以及线粒体在该模型中小肠损伤、凋亡过程中的作用。为肝移植过程中小肠相关保护措施的实施提供新的可行的方法和理论支持。
　　方法：
　　选择40只健康雄性C57BL/6小鼠，随机分为8组:①正常对照组(A);预处理组，包含:②GLP-2预处理组(B1)，③:GLP-2预处理+淤血再灌注组(B2)，④:PBS预处理+淤血再灌注组(B3);⑤:GLP-2预处理+淤血再灌注+GLP-2治疗组(C);治疗组，包含⑥:淤血再灌注+GLP-2治疗组(D1)，⑦:淤血再灌注+PBS治疗组(D2);⑧淤血再灌注组(E)。采用夹闭-开放肠系膜上静脉的方式（即淤血再灌注）模拟肝移植手术过程中无肝期的小肠淤血再灌注动物模型，留取小肠组织进行检测。检测指标:HE染色和透射电镜观察小肠形态学和超微结构的变化;免疫组织化学染色检测小肠增殖指标Ki67蛋白的表达，TUNEL染色检测小肠的凋亡情况;western blot检测小肠组织中cleaved caspase-3的表达水平。
　　结果：
　　(1)小肠淤血再灌注模型中小鼠小肠形态学及超微结构改变:与正常对照组相比，淤血再灌注组中央乳糜管扩张，小肠绒毛上皮细胞变性;PBS预处理+淤血再灌注组肠绒毛变短变粗，中央乳糜管扩张，其余组小肠也有不同程度的损伤但均较PBS预处理+淤血再灌注组轻。超微结构中，与正常对照组组相比，PBS预处理+淤血再灌注组和淤血再灌注组细胞核中染色质出现固缩、边集等现象;线粒体方面，与正常对照组相比，PBS预处理+淤血再灌注组和淤血再灌注组线粒体出现明显的肿胀，空泡变性，嵴消失等现象，其余组也可见线粒体损伤，但较轻。和淤血再灌注+GLP-2治疗组相比，淤血再灌注+PBS治疗组线粒体损伤稍重;GLP-2预处理+淤血再灌注组、GLP-2预处理+淤血再灌注+GLP-2治疗组线粒体损伤较轻，且以GLP-2预处理+淤血再灌注+GLP-2治疗组组损伤最轻。
　　(2)小肠组织中细胞增殖:给予GLP-2处理的各组和其他组相比，可见明显的增殖。和PBS预处理+淤血再灌注组相比，GLP-2预处理+淤血再灌注组小肠隐窝增殖明显增加;淤血再灌注+GLP-2治疗组小肠隐窝增殖也明显多于淤血再灌注+PBS治疗组;而GLP-2预处理+淤血再灌注+GLP-2治疗组小肠隐窝增殖最明显。
　　(3)小肠组织细胞凋亡:与正常对照组相比，其余组小鼠小肠组织发生了明显的细胞凋亡，以PBS预处理+淤血再灌注组最明显。与PBS预处理+淤血再灌注组相比，GLP-2预处理+淤血再灌注组小肠组织凋亡明显减少。和淤血再灌注+GLP-2治疗组相比，淤血再灌注+PBS治疗组凋亡增加但没有统计学意义，而GLP-2预处理+淤血再灌注+GLP-2治疗组小肠组织凋亡明显减少，同两者有统计学差异。
　　(4)小肠组织中cleaved caspase-3的表达:与正常对照组相比，其余组cleavedcaspase-3表达均增加，但以PBS预处理+淤血再灌注组最明显。与PBS预处理+淤血再灌注组相比，GLP-2预处理+淤血再灌注组小肠组织cleavedcaspase-3表达量明显减少;与淤血再灌注+PBS治疗组相比，淤血再灌注+GLP-2治疗组cleaved caspase-3表达减少，GLP-2预处理+淤血再灌注+GLP-2治疗组cleaved caspase-3表达进一步减少，但三者无统计学差异。
　　结论：
　　1.GLP-2减轻小肠淤血再灌注模型中肠粘膜的损伤并促进肠上皮的增殖。
　　2.GLP-2减少小肠淤血再灌注模型中损伤小肠的凋亡，其过程可能与线粒体有关。
　　3.GLP-2减轻肝移植手术导致的小肠损伤中，术前给药优于术后给药;术前术后联合给药优于术前单独给药。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1．实验材料

1．1 实验动物

2．1 主要仪器和设备

1．3 主要试剂和药品

2．实验方法

2．1 主要溶液配制

2．2 实验动物分组

2．3 动物给药方式及模型的建立

2．4 术前准备

2．5 样本收集

2．6 小肠组织石蜡包埋

2．7 小肠组织石蜡切片

2．8 小肠组织HE染色

2．9 小肠组织超微结构观察

2．10 小肠增殖指标Ki67蛋白表达检测

2．11 TUNEL细胞凋亡原位检测

2．12 小肠组织总蛋白提取

2．13 BCA法蛋白浓度测定

2．14 Western blotting实验

2．15 统计学处理

结果

1．小鼠小肠淤血再灌注模型中小肠的病理学改变

2．小鼠小肠在小肠淤血再灌注模型中超微结构的变化

3．小肠淤血再灌注模型中小鼠小肠组织增殖指标Ki67蛋白表达检测

4．小鼠小肠组织在小肠淤血再灌注模型中细胞凋亡原位检测(TUNEL)

5．小肠淤血再灌注模型中各组小鼠小肠组织cleaved caspase-3的表达变化

讨论

结论

参考文献

综述 GLP-2临床应用的研究进展

致谢