GLP-2对小肠淤血再灌注损伤的预防缓解作用及相关机制研究

摘要

目的:
　　目前，肝移植已经成为肝硬化、肝癌等各种重型肝疾病治疗的最佳手段。然而，临床肝移植过程中，由于肝脏门脉系统夹闭后小肠血流淤积而后开放血流造成了小肠不可避免的损伤。损伤小肠黏膜细胞的恢复对术后治疗和预后非常重要。肝移植后小肠的淤血再灌注损伤使肠黏膜细胞凋亡导致其通透性改变，进而导致细菌移位。胰高血糖素样肽-2(GLP-2)具有肠道特异性的营养效应，间接刺激隐窝细胞的增殖，抑制黏膜上皮细胞的凋亡，进而增强肠道生长并降低肝移植后损伤小肠的严重程度。减少肠道炎症，营养肠神经元，因此它可能是一种有效的肠营养生长因子，具有潜在的预防和治疗肝移植手术对小肠造成的损伤。
　　本实验目的是通过探讨临床肝移植过程中小肠淤血再灌注损伤模型，经胰高血糖素样肽-2(GLP-2)预处理后，小肠在微观结构和超微结构中的形态学变化以及相关信号因子的表达，从而进一步阐明小肠淤血再灌注损伤机制。对深入了解小肠淤血再灌注损伤过程、相关小肠保护措施的研发具有重要的研究意义。
　　方法:
　　选取健康雄性C57BL/6小鼠40只，随机分为5组，每组8只。实验采用无损伤静脉夹以夹闭/开放门静脉的方式，模拟肝移植手术过程中无肝期的小肠淤血再灌注动物模型。①:正常对照组(A);②:GLP-2预处理组(B);③:淤血再灌注组(C);④:GLP-2预处理+淤血再灌注组(D);⑤:PBS预处理+淤血再灌注组(E)，留取空肠、回肠组织进行相关检测。
　　检测指标:HE颜色观察小肠形态学变化;透射电镜观察小肠黏膜上皮细胞超微结构的改变;实时荧光定量PCR检测小肠组织中ZO-1，ERK1/2mRNA的表达水平;Western blot检测小肠组织中cleaved caspase-3的表达水平。
　　结果:
　　(1)小肠淤血再灌注损伤过程中小鼠小肠形态学及超微结构改变:与正常对照组相比，GLP-2预处理组小肠绒毛长度增加，隐窝细胞数量增加;与淤血再灌注组相比，GLP-2预处理+淤血再灌注组小肠绒毛变长且轻微脱落，损伤较轻。小肠的超微结构也发生了明显的损伤改变，淤血再灌注组微绒毛明显变短且数量减少，细胞核形态改变，染色质边集，核仁成分分离，线粒体内室扩张，基质变稀，电子密度明显下降，呈空泡状。与淤血再灌注组相比，GLP-2预处理+淤血再灌注组微绒毛明显变长且数量增加，细胞核染色质损伤减轻，细胞膜完整，线粒体基质电子密度明显升高，嵴损伤得到明显改善。
　　(2)小肠淤血再灌注模型中小肠组织ERK1/2的表达:与正常对照组相比，GLP-2预处理组ERK1/2升高;与淤血再灌注组相比，GLP-2预处理+淤血再灌注组ERK1/2表达显著升高。
　　(3)小肠淤血再灌注模型中小肠组织ZO-1的表达:与正常对照组相比，GLP-2预处理组ZO-1下降;与淤血再灌注组相比，GLP-2预处理+淤血再灌注组ZO-1表达升高。
　　(4)小肠淤血再灌注模型中空肠组织cleaved caspase-3的表达:与正常对照组相比，GLP-2预处理组cleaved caspase-3下降;与淤血再灌注组相比，GLP-2预处理+淤血再灌注组cleaved caspase-3表达降低。
　　结论:
　　(1)胰高血糖素样肽-2预处理后，受损小肠绒毛长度增加，隐窝细胞数量增多，小肠损伤明显减轻。
　　(2)胰高血糖素样肽-2预处理后，小肠黏膜细胞的微绒毛、细胞核、线粒体损伤减轻。
　　(3)胰高血糖素样肽-2预处理后，小鼠受损小肠中ERK1/2和ZO-1在mRNA水平表达上调可能在防止小肠淤血再灌注损伤中发挥了重要作用。
　　(4)胰高血糖素样肽-2预处理后，小鼠受损小肠中cleaved caspase-3蛋白表达下调可能在防止小肠淤血再灌注损伤中发挥了重要作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1．1 实验动物

1．2 实验仪器

1．3 试剂与耗材

2 实验方法

2．1 溶液配制

2．2 动物实验

2．3 小肠组织蛋白提取

2．4 小肠组织蛋白浓度测定(BCA法)

2．5 Western blot实验

2．6 动物组织RNA提取

2．7 逆转录

2．8 实时荧光定量PCR

2．9 动物组织石蜡包埋

2．10 石蜡切片和贴片

2．11 石蜡切片HE染色

2．12 动物组织超微结构观察

2．13 结果处理

结果

讨论

结论

参考文献

综述 胰高血糖素样肽-2的研究进展

致谢