USP49-FKBP5-AKT信号通路与胰腺癌耐药性机制

摘要

目的:丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT（也被称为PKB），是细胞生长的中心调控因子。AKT信号参与细胞体内多种信号途径，具有广泛的生物学效应，其活性异常不仅能导致细胞恶性转化，而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、血管生成以及细胞外基质的降解等相关，它的超活化导致肿瘤的发生、发展以及化疗耐受。之前的研究表明，磷酸化酶PHLPP能够对AKT-Ser473位点去磷酸化负调控AKT的活性。FKBP5作为骨架蛋白，可促进PHLPP-AKT蛋白相互作用，并参与PHLPP介导的AKT-Ser473去磷酸化，FKBP5通过调控AKT信号通路中起到了抑制肿瘤发生的作用。但是，目前关于FKBP5的调控机制还不是很清楚。在本文中，我们主要寻找FKBP5的调控蛋白，研究其对FKBP5的调控机制以及该蛋白是如何通过FKBP5-AKT通路调控肿瘤的生长和对化疗药物的耐受性。
　　方法:(1)通过串联亲和纯化及质谱分析（TAP-MS）寻找FKBP5的互作蛋白。(2)利用病毒感染的方法建立FKBP5互作蛋白的过表达或敲低细胞稳定株，免疫印迹法检测FKBP5的蛋白表达及稳定性。(3)利用体内和体外泛素化实验，检测目标蛋白对FKBP5的泛素化调控情况。(4)利用病毒感染的方法建立FKBP5及其互作蛋白的单敲低与双敲低细胞稳定株，免疫印迹法检测AKT及其下游蛋白的磷酸化变化情况。(5)利用MTT实验、软琼脂实验检测目标蛋白对胰腺癌细胞生长的影响。(6)建立动物模型，检测目标蛋白对肿瘤生长的影响。(7)利用免疫组化技术检测FKBP5、P473-AKT和目标蛋白在组织芯片中的表达情况。(8)检测目标蛋白如何影响胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性。
　　结果:(1)运用串联亲和纯化及质谱分析发现了FKBP5的互作蛋白去泛素化酶USP49，并利用免疫共沉淀实验验证了二者的相互作用。(2)敲低USP49能够下调FKBP5的蛋白水平，FKBP5的蛋白稳定性也随之降低。(3)敲低USP49增加FKBP5的泛素化水平，过表达USP49则降低FKBP5的泛素化水平。(4)稳定敲低USP49后，AKT及下游蛋白的磷酸化水平增加。但是在敲低FKBP5的基础上再敲低USP49，AKT及下游蛋白的磷酸化平便不再变化。(5)稳定敲低USP49能够促进胰腺癌细胞的增殖;但是在敲低FKBP5的基础上再敲低USP49，则不再进一步促进;(6)体内实验表明，稳定敲低USP49能够促进小鼠肿瘤的生长;在敲低USP49基础上再过表达FKBP5，肿瘤的生长能力又恢复正常。(7)免疫组化结果表明，USP49与FKBP5在胰腺癌组织中表达呈正相关，而USP49和P473-AKT表达呈负相关。(8) USP49能够增加胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性。
　　结论:本文发现去泛素化酶USP49，作为一个新的AKT信号通路调控因子，能够去泛素化稳定FKBP5，加强PHLPP介导的AKT的去磷酸化调节。此外，USP49能够抑制胰腺癌细胞增殖，促进胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性。临床上，USP49在胰腺癌组织样本中低表达，且与FKBP5表达呈正相关而与AKT-Ser473磷酸化的表达呈负相关。本文整体表明，USP49作为AKT通路新的调控因子，在胰腺癌肿瘤发生和化疗耐药方面发挥非常重要的作用。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

一．材料

二．试验方法

实验结果

一、FKBP5互作蛋白的鉴定

二、USP49稳定FKBP5的蛋白水平

三、USP49调控FKBP5蛋白的泛素化水平

四、USP49通过FKBP5的蛋白水平调控AKT信号途径

五、USP49抑制胰腺癌细胞增殖且依赖于AKT信号通路

六、USP49通过直接调控FKBP5影响胰腺癌细胞生长

七、体内动物实验表明，USP49通过直接调控FKBP5影响肿瘤形成

八、在胰腺癌组织样本中，USP49与FKBP5及P473-AKT蛋白表达相关情况

九、USP49通过AKT信号通路调控胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性

讨论

结论

参考文献

AKT蛋白激酶和肿瘤耐药

攻读学位期间发表文章情况

致谢