小鼠骨髓源性树突状细胞通过mGluR4影响B16细胞黑素合成及姜黄素的作用机制研究

摘要

一、目的与意义:
　　白癜风是一种常见的获得性、进展性的色素脱失性皮肤病，全世界发病率约为0.5%~1%。发病机制理论主要包括氧化应激学说、神经化学因子学说、遗传学说、黑素细胞自身破坏学说、自身免疫学说等。诸多研究证实免疫学机制在白癜风的发生和进展中发挥关键作用。目前的治疗方法主要有外用糖皮质激素、钙调磷酸酶抑制剂、光疗和手术移植等。然而对于泛发型等难治性白癜风，尚无有效的治疗手段。深入研究白癜风的免疫发病机制，并在此基础上开发生物靶向药物，对于提高该皮肤顽症的治愈率具有重要的临床意义。
　　辅助性T细胞17(T helper cell17，Th17)是近年来新发现的CD4+T细胞亚群，可特征性的分泌白介素17(interleukin17，IL-17)。树突状细胞（dendritic cells，DC）是已知的体内功能最强的专职抗原提呈细胞，能通过提供抗原、共刺激和细胞因子（如IL-6、IL-23等）信号促进Th17细胞分化。维甲酸相关孤核受体γt（retinoic acid-related organ receptorsγt，RORγt）是诱导Th17细胞分化所必需的谱系限制性转录因子。Th17细胞在对真菌和细胞外细菌的免疫防御中起关键作用，但也参与许多自身免疫性疾病的病理过程。目前普遍认为非节段型白癜风的主要发病机制是免疫学异常。新近研究表明白癜风患者系统、组织和细胞的IL-17表达水平增加，且皮损处网状真皮层出现Th17细胞浸润。并有研究发现IL-17表达水平和白癜风疾病的活动性、皮损范围和严重性之间存在显著正相关性。上述研究提示Th17细胞在白癜风免疫发病过程中的重要作用，而具体的机制尚未完全明确。
　　代谢型谷氨酸受体4（metabotropic glutamate receptor4，mGluR4）属于III组代谢型谷氨酸受体的成员，是主要位于神经元突触前的一种受体，其功能是调节谷氨酸（作为自身受体）或 GABA（作为异受体）的释放。在帕金森病、焦虑、抑郁症、慢性疼痛等疾病的治疗中，激活 mGluR4已经成为一种前景广阔的治疗方法。近年来关于谷氨酸信号通路在非神经系统，如皮肤组织和免疫系统等中的研究逐渐成为学者们探讨的热点。研究发现谷氨酸受体在多种免疫细胞中均有表达，如T细胞、B细胞、DC以及巨噬细胞等。但该通路对免疫细胞具体功能的影响及其相关作用机制尚不明确。近年来Francesca Fallarino等报道，mGluR4敲除的小鼠更易发生实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalo-myelitis，EAE），并启动Th17免疫应答；而野生型小鼠经PHCCC（mGluR4的选择性增强剂）治疗后，可通过促进调节性T细胞（Regulatory T cells，Treg）发育，抑制Th17免疫应答而产生EAE抗性。这些结果表明mGluR4可以调节适应性免疫，并且抑制神经炎症。
　　近期研究发现神经源性因素可能诱发多种皮肤疾病或者加速皮肤疾病进展。从解剖学角度看，神经细胞与黑素细胞共同起源于胚胎外胚层的神经嵴。此外，神经系统参与许多皮肤组织的生理病理过程，在皮肤屏障功能和皮肤炎症免疫等方面发挥着重要作用。因此在皮肤水平，基于神经和免疫系统之间功能交叉的创新概念逐渐兴起。然而，目前国内外尚未报道关于谷氨酸信号通路在白癜风免疫发病机制中的研究。
　　综上所述，我们选择 mGluR4作为神经、免疫、皮肤网络中多系统动态作用的关键媒介，来研究白癜风发病过程中的免疫反应调节。研究结果将有助于进一步阐明Th17细胞在白癜风免疫发病机制中的作用，并为开发以相关的蛋白、基因为靶位的生物靶向药物提供实验依据。
　　姜黄素是姜黄的主要生物活性成分，能有效的抗炎、抗氧化和抗肿瘤。近来研究发现姜黄素可以治疗多种自身免疫性疾病（如关节炎、动脉粥样硬化等）。联合应用UVB光疗和四氢类姜黄素（源自姜黄素类化合物）治疗白癜风效果优于单用UVB光疗。姜黄素还能够减少同种异体反应性 T细胞的增殖，并显著抑制 Th17细胞分化。目前，姜黄素调节 Th17细胞分化的确切机制尚未完善。前期研究发现，姜黄素可以诱导人黑素瘤细胞系A375和C8161自噬、并抑制细胞增殖和侵袭，可能与蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB/AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路抑制有关。姜黄素还可通过抑制促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核转录因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信号通路而抑制DC成熟。mGluR4活化能刺激MAPK和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)/AKT信号通路。然而目前国内外尚未报道关于姜黄素与mGluR4信号通路的研究。
　　因此，我们研究了姜黄素对Th17细胞分化的影响，并初步探讨了该作用机制是否与mGluR4信号通路相关，为姜黄素治疗白癜风提供了新的实验依据。
　　二、实验方法:
　　1、从4~8周C57小鼠股骨、胫骨中分离、提取DC前体细胞。加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）及IL-4诱导其分化为未成熟DC，以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）孵育48 h刺激其成熟。每天在倒置显微镜下观察骨髓源性树突状细胞（bone marrow derived-dentritic cells，BMDC）形态，并拍照。
　　2、在透射电镜下观察BMDC的超微结构，并以流式细胞仪检测BMDC表面标记物 CD11c、CD80、CD86、主要组织相容性复合体Ⅱ类(major histocompatibility complex class II,MHC II)的表达。
　　3、采用反转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、实时荧光定量PCR（Real time Quantitative PCR，qPCR）及western blot法检测BMDC表面mGluR4的表达。
　　4、用瞬时转染技术将mGluR4小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染入小鼠BMDC，下调mGluR4表达，采用qPCR、western blot方法检测敲减效率。
　　5、用密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞，并进行CD4+T细胞免疫磁珠分选。将小鼠BMDC以不同比例与CD4+T细胞共培养，采用CCK-8法检测BMDC促进与其共培养T细胞增殖的能力。
　　6、采用qPCR方法检测mGluR4基因敲减对小鼠BMDC IL-6、IL-23 mRNA水平，以及与BMDC共培养体系中IL-17A、RORγt mRNA水平的影响。
　　7、将mGluR4基因敲减的小鼠BMDC与CD4+T细胞共培养，以其培养基上清刺激小鼠B16细胞，荧光显微镜下观察对细胞形态的影响，并拍照。
　　8、将mGluR4基因敲减的小鼠BMDC与CD4+T细胞共培养，以其培养基上清刺激小鼠B16细胞，采用qPCR方法检测小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)、酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)、酪氨酸酶相关蛋白-1(tyrosinase related protein1,TRP-1)等基因mRNA水平的变化。
　　9、将mGluR4基因敲减的小鼠BMDC与CD4+T细胞共培养，以其培养基上清刺激小鼠B16细胞，检测对B16细胞黑素合成和TYR活性的影响。
　　10、用不同浓度姜黄素处理BMDC，用CCK-8法检测对细胞活性及BMDC促进共培养CD4+T细胞增殖能力的影响。
　　11、用qPCR方法检测姜黄素对小鼠 BMDC IL-6、IL-23 mRNA水平，以及与BMDC共培养体系中IL-17A、RORγt mRNA水平的影响。
　　12、采用qPCR及western blot法检测姜黄素对BMDC表面mGluR4表达的影响。
　　三、结果:
　　（一）BMDC表面mGluR4下调促进Th17细胞分化
　　1、原代培养的小鼠BMDC倒置显微镜和透射电镜镜下观察，均符合DC的典型形态。流式结果显示MHC-II+CD11c+细胞比例在80%以上，细胞纯度较高，CD80+、CD86+、MHC-II+细胞比例均显著高于未成熟组。上述结果提示小鼠BMDC培养成功，为后续实验研究提供了可靠的技术基础。
　　2、检测到mGluR4在小鼠BMDC表面表达。
　　3、siRNA转染成功下调小鼠BMDC表面mGluR4的表达。
　　4、下调mGluR4提高小鼠BMDC的IL-6、IL-23 mRNA水平。
　　5、下调mGluR4提高小鼠BMDC促进CD4+T细胞增殖的能力，并增加与BMDC共培养体系中IL-17A、RORγt的mRNA水平。
　　（二）BMDC表面mGluR4下调影响小鼠B16细胞形态与黑素合成
　　1、下调mGluR4破坏小鼠B16细胞形态。
　　2、下调mGluR4降低黑素合成相关基因MITF、TYR、TRP-1等的mRNA水平。
　　3、下调mGluR4减少小鼠B16细胞黑素合成。
　　4、下调mGluR4抑制小鼠B16细胞TYR活性。
　　（三）姜黄素通过激活mGluR4而抑制Th17细胞分化
　　1、姜黄素浓度>25μM时，对细胞有明显的毒性作用。
　　2、25μM姜黄素抑制小鼠BMDC IL-6、IL-23 mRNA水平。
　　3、25μM姜黄素抑制BMDC刺激CD4+T细胞增殖的能力，并降低与BMDC共培养体系中IL-17A、RORγt的mRNA水平。
　　4、下调mGluR4促进CD4+T细胞向Th17细胞分化。
　　5、25μM姜黄素增加小鼠BMDC表面mGluR4的表达。
　　四、结论:
　　（一）BMDC表面mGluR4敲减可促进Th17细胞分化
　　1、BMDC可作为DC表型与功能研究的较理想的体外模型。
　　2、小鼠BMDC表面有mGluR4的表达。
　　3、下调BMDC表面 mGluR4的表达，可促进与BMDC共培养的CD4+T细胞向Th17细胞分化。
　　（二）BMDC表面mGluR4敲减诱导的Th17细胞分化可影响小鼠B16细胞形态与黑素合成
　　1、BMDC表面mGluR4的表达下调是诱导Th17分化的必要因素，而后者与B16细胞黑素合成的相关基因有关。
　　2、BMDC表面mGluR4的表达下调诱导Th17分化等机制有可能是白癜风发病的免疫学机制之一。
　　3、BMDC表面mGluR4有可能成为调控白癜风患者免疫学异常的治疗靶位。
　　（三）姜黄素可通过活化BMDC表面mGluR4而抑制Th17细胞分化
　　1、姜黄素可减弱BMDC刺激CD4+T细胞增殖的能力，并抑制Th17细胞分化。
　　2、下调BMDC表面mGluR4的表达，可诱导Th17细胞分化。
　　3、姜黄素能够增加小鼠BMDC表面mGluR4的表达，可能是其抑制Th17细胞分化的机制。

目录

声明

第一部分BMDC表面mGluR4敲减促进Th17细胞分化的作用机制研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分mGluR4通过诱导Th17细胞分化影响小鼠B16细胞形态与黑素合成的作用机制研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

第三部分姜黄素通过mGluR4信号通路抑制Th17细胞分化的作用机制研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述:谷氨酸信号通路调节T细胞功能的作用机制研究

附录英文缩略词表

攻读学位期间发表文章情况

致谢