泛素蛋白酶体系统与急性髓细胞白血病细胞自噬性死亡关系的研究

摘要

目的：泛素蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)是存在于真核生物中的除自噬系统以外的另一种非常重要的蛋白质降解方式，它在各种细胞功能和体内稳态中均发挥着十分重要的作用。去泛素羧基末端水解酶(UCH，Ubiquitin carboxyterminal hydrolases)和泛素（Ub)分别是UPS家族中的一员，越来越多的研究证实，UCH和Ub与许多肿瘤的发生和发展均有着十分紧密的联系。自噬是普遍存在于真核细胞中的一条降解胞内蛋白质的主要途径，它主要对存在于体内的一些细胞器和长寿命蛋白进行降解。有研究表明自噬系统和泛素蛋白酶体系统之间存在着紧密的联系。SQSTM1/ P62(sequestosome1)可以通过巨自噬和蛋白酶体选择性的降解多聚泛素化的蛋白质。本研究的主要目的：第一：我们首先通过检测自噬诱导剂雷帕霉素、自噬抑制剂3-MA分别处理HL-60细胞前后的变化探讨自噬系统对泛素蛋白酶体系统以及P62的影响。第二：通过观察蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理HL-60细胞前后的差异探讨泛素蛋白酶体系统对自噬及P62的影响。第三：硼替佐米与雷帕霉素联合应用后观察泛素蛋白酶体系统与自噬之间的相互作用以及对P62的影响。第四：检测急性髓白血病初发患者外周血中 LC3Ⅱ、UCH-L3、P62三者 mRNA的表达变化，进一步探讨急性髓白血病与自噬和泛素蛋白酶体以及P62之间的关系。希望能够为白血病的监测与治疗提供一个新的方向。
　　方法：1.自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA分别处理HL-60细胞后，CCK8法检测细胞的生长增殖情况，流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，透射电镜下观察自噬小体的形成情况，RT-PCR检测LC3Ⅱ、UCH-L3、P62三者mRNA水平的表达变化，Western-blot检测LC3Ⅱ、UCH-L3、Ub、P62四者蛋白水平的表达变化。
　　2.泛素蛋白体抑制剂硼替佐米处理 HL-60细胞后，CCK8法检测细胞的生长增殖情况，流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，透射电镜下观察自噬小体的形成情况，RT-PCR检测LC3Ⅱ、UCH-L3、P62三者mRNA水平的表达变化，Western-blot检测LC3Ⅱ、UCH-L3、Ub、P62四者蛋白水平的表达变化。
　　3.泛素蛋白酶体抑制剂硼替佐米与自噬诱导剂雷帕霉素联合应用处理 HL-60细胞后，透射电镜下观察自噬小体的形成情况，RT-PCR检测LC3Ⅱ、UCH-L3、P62三者mRNA水平的表达变化，Western-blot检测LC3Ⅱ、UCH-L3、Ub、P62四者蛋白水平的表达变化。
　　4.提取急性髓白血病初发患者外周血的单个核细胞，RT-PCR检测与健康对照组相比LC3II、UCH-L3、P62三者 mRNA水平的表达变化。
　　结果：1.自噬诱导剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA对细胞的生长抑制率均具有时间和浓度依赖性；随着时间的延长细胞凋亡比例有所提高；雷帕霉素处理组电镜下观察到有自噬小体的形成；雷帕霉素分别处理 HL-60细胞后，RT-PCR检测 LC3Ⅱ、UCH-L3二者 mRNA的表达均上调，P62 mRNA的表达下调，Western-blot检测LC3Ⅱ、UCH-L3、Ub三者蛋白的表达均上调，P62蛋白的表达下调；3-MA处理HL-60细胞后，RT-PCR检测LC3II、UCH-L3二者的mRNA表达均下调，P62 mRNA的表达上调，Western-blot检测LC3Ⅱ、UCH-L3、Ub三者的蛋白表达均下调，P62蛋白的表达上调；以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。
　　2.泛素蛋白酶体抑制剂硼替佐米对细胞的生长抑制率具有时间和浓度依赖性，且随着时间的延长细胞凋亡比例有所提高；电镜下观察到大量自噬小体的形成；硼替佐米处理HL-60细胞后，RT-PCR检测LC3Ⅱ、P62二者的mRNA表达均上调，UCH-L3 mRNA表达下调；Western-blot检测LC3Ⅱ、P62二者的蛋白表达均上调,UCH-L3、Ub二者的蛋白表达均下调；以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。
　　3.硼替佐米+雷帕霉素共同处理HL-60细胞后，电镜下观察到有自噬小体的形成，RT-PCR检测LC3Ⅱ、P62二者的mRNA表达均上调，UCH-L3 mRNA表达下调；Western-blot检测 LC3Ⅱ、P62二者的蛋白表达均上调,UCH-L3、Ub二者的蛋白表达均下调。硼替佐米+3-MA处理HL-60后，电镜下观察到有自噬小体的形成，但数量少于硼替佐米+雷帕霉素共同处理组，以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。
　　4.外周血基因水平检测结果显示，急性髓白血病初发患者与健康对照组相比较LC3II mRNA的表达上调，UCH-L3 mRNA的表达下调，P62 mRNA的表达上调，以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。
　　结论：1.雷帕霉素诱导急性髓白血病细胞HL-60自噬后，UCH-L3、P62、Ub在基因与蛋白水平与对照组相比均发生了明显的变化，而自噬抑制剂3-MA却从基因和蛋白水平抑制了这种表达变化，因此表明泛素蛋白酶体系统与P62二者可能参与雷帕霉素诱导的急性髓白血病细胞的自噬发生过程。
　　2.泛素蛋白酶体抑制剂硼替佐米作用于HL-60细胞后细胞自噬水平升高，提示抑制泛素蛋白酶体系统可能促进自噬的发生。
　　3.硼替佐米与雷帕霉素共同处理HL-60后细胞自噬水平较雷帕霉素单独处理时升高，说明自噬系统与泛素蛋白酶体系统之间存在着协同作用。
　　4.急性髓白血病初发患者外周血中LC3II、UCH-L3、 P62的表达变化说明急性髓细胞白血病的发生可能是自噬、泛素蛋白酶体系统及P62共同协调作用的结果。

目录

声明

前言

材料和方法

1.材料

2.方法

3.流式细胞仪检测细胞凋亡

4.透射电子显微镜（TEM）下观察自噬小体

5.逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

6. 蛋白质免疫印迹(Western blot)

7.RT-PCR检测外周血UCH-L3，P62，LC3ⅡmRNA的表达情况

结果

讨论

结论

参考文献

综述:P62蛋白在肿瘤中作用的研究进展

致谢