乳杆菌对高果糖诱导小鼠高尿酸血症的防治作用及机制探讨

摘要

目的:
　　探索短乳杆菌DM9505对高果糖（High Fructose，HF）诱导的高尿酸血症模型小鼠的影响，为益生菌制剂的开发利用奠定基础。
　　方法:
　　1、分组与造模
　　本实验将Balb/c雄性小鼠随机分为正常对照组(Control)，高果糖模型组(HF)和益生菌干预组(Probiotic)，每组15只。模型组和益生菌干预组小鼠同时给予15％(w/v)的高果糖水自由饮用，益生菌干预组同时予以短乳杆菌DM9505灌胃(1×109cfu/kg，0.2ml/天)处理，正常对照组给予自来水自由饮用。
　　2、DM9505对高果糖喂养小鼠尿酸生成的果糖代谢机制的影响
　　每天观察记录各组小鼠的饮食及活动状态，每一周测定各组小鼠的体重和血糖，实验第8周后处死所有小鼠。用酶法试剂盒检测各组小鼠血清样本的血尿酸(Serum uric acid，UA)、血脂全套指标。将小鼠肝脏组织切片并进行HE染色，观察肝脏组织的病理改变;肝脏组织进行匀浆，用ELISA方法检测各组小鼠肝脏组织中三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)、单磷酸腺苷(Adenosine Monophosphate，AMP)、肌苷(Inosine)、转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1，TGF-β1)和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平的变化以及小鼠粪便Inosine水平;用RT-qPCR方法检测各组小鼠肝脏组织中NOX4mRNA表达水平的变化。
　　3、DM9505对高果糖喂养小鼠尿酸生成的调节机制的影响
　　将肝脏组织进行匀浆，用ELISA方法检测各组小鼠肝脏组织中脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、干扰素α(Interferonα，IFN-α)、黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，XOD)浓度和XOD活性的变化;用RT-qPCR方法检测各组小鼠肝脏组织中XODmRNA表达水平的变化。
　　4、DM9505对高果糖诱导的高血尿酸小鼠肠道菌群的调节作用
　　提取各组小鼠结肠内容物DNA，使用PCR-DGGE方法和切胶测序方法鉴定小鼠肠道菌群变化特点，并应用Illuminate Hiseq PE25016SrDNA测序分析技术对各组小鼠肠道菌群进行组间物种差异分析、生物分类学上的比较、Beta多样性分析、Alpha多样性分析和CCA分析。
　　结果:
　　1、DM9505对高果糖喂养小鼠尿酸生成的果糖代谢机制的影响
　　各组小鼠体重和血糖在实验一周后持续上升。实验8周后，模型组与正常对照组间，体重和血糖明显升高（P＜0.05），同时UA、TG、TC等基础指标也显著增加(P＜0.05);而经益生菌干预后，除小鼠UA水平明显降低外（P＜0.05），其他各项指标均无明显改善。
　　高果糖模型组小鼠肝脏组织中的AMP、Inosine、TGF-β1、NOX4mRNA、ROS及粪便中Inosine的表达量均比正常对照组明显上升（P＜0.05），而ATP水平明显降低（P＜0.05）;经过益生菌干预后，除ATP、AMP含量无明显变化外，小鼠其他各物质的表达水平均有不同程度的下降（P＜0.05）。各组小鼠肝脏组织HE染色观察发现，与正常对照组相比，高果糖模型组小鼠肝脏细胞肿胀膨大明显;而益生菌组小鼠肝细胞形态改变有所改善。
　　2、DM9505对高果糖喂养小鼠尿酸生成的调节机制的影响
　　高果糖模型组小鼠肝脏组织中的LPS、IFN-α、XOD浓度、XOD活性以及XODmRNA的表达水平均比正常对照组明显升高（P＜0.05），而经过益生菌干预后，各组小鼠的LPS、IFN-α、XOD浓度、XOD活性及XODmRNA表达水平均明显降低（P＜0.05）。
　　3、DM9505对高果糖诱导的高血尿酸小鼠肠道菌群的调节作用
　　PCR-DGGE的凝胶成像图显示，高果糖模型组小鼠的肠道菌群与正常对照组小鼠的肠道菌群数量和结构之间存在着明显差异:两组之间存在许多差异条带，且模型组小鼠的肠道菌群条带数与正常组小鼠相比明显减少。条带切胶测序结果显示模型组小鼠条件致病菌增加，而益生菌干预组有益菌增加。
　　各组小鼠结肠内容物16SrDNA高通量测序结果显示。与正常对照组相比，模型组的菌种数量和菌群多样性明显较低;UPGMA聚类树显示，益生菌干预组与正常对照组离得更近，相似性更大;模型组与正常组和益生菌干预组离得远，相似性较低。
　　模型组与正常对照组相比:拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌减少，而变形菌门（Proteobacteria）的真杆菌(Eubacterium)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)及肠球菌(Enterococcus)细菌增多，以上结果表明高果糖模型小鼠的肠道菌群结构发生了改变，其正常菌群减少而条件致病菌增加。
　　益生菌干预组小鼠肠道菌群与模型组小鼠相比:拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌水平明显比模型组多，厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)增加;而厚壁菌门(Firmicutes)细菌及变形菌门的糖杆形菌属(Saccharibacteria)减少。以上结果显示，益生菌干预组小鼠肠道正常菌群增加，而条件致病菌减少了。
　　结论:
　　1、短乳杆菌DM9505一方面可调果糖代谢中间产物-Inosine的水平;另一方面可影响LPS、IFN-α的浓度刺激XOD的表达及其浓度与活性，这些均可改善高果糖饮食诱导的小鼠高尿酸血症。
　　2、短乳杆菌DM9505可在一定程度上调整高果糖诱导的小鼠肠道菌群紊乱，特别是能使正常菌群增加，条件致病菌减少。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

1．1 实验菌株

1．2 实验动物

1．3 主要实验药品及试剂

1．4 主要实验仪器

2．2 样本采集

2．4 血液样本检测G1u、UA、TG、T-CHO、LDL-C、ALT水平

2．6 RT-qPCR方法检测各组小鼠肝脏组织中XOD、NOX4的表达

2．7 肠道菌群多样性检测

2．8 16SrDNA高通量测序

2．9 统计学分析

1 短乳杆菌DM9505对高果糖饮食诱导的血尿酸及糖脂代谢的影响

1．1 各组小鼠体重及血糖变化

1．2 各组小鼠血液中血脂水平的变化

1．3 各组小鼠肝功能指标变化及病理改变

1．4 各组小鼠血尿酸、TGF- β1、NOX4mRNA及ROS水平比较改变

2 短乳杆菌DM9505对高果糖喂养小鼠尿酸生成的果糖代谢机制的影响

3 短乳杆菌DM9505对高果糖喂养小鼠尿酸生成的调节机制的影响

4 短乳杆菌DM9505对高果糖诱导的高血尿酸小鼠肠道菌群的调节作用

讨论

结论

参考文献

综述 肠道菌群与高果糖饮食及相关疾病的关系探讨

攻读学位期间发表论文情况

致谢