三氧化二砷导致小鼠非酒精性脂肪性肝炎及牛磺酸保护作用的研究

摘要

目的:探究三氧化二砷(As2O3)暴露引起小鼠非酒精性脂肪性肝炎的作用及牛磺酸对肝脏损伤的保护作用机制。
　　方法:本研究以C57BL/6J小鼠为体内实验模型，以HepG2为体外实验模型。C57BL/6J小鼠经As2O3暴露（0、1、2及4mg/L）及牛磺酸(250mg/Kg)干预后，采用HE染色及油红O染色法，观察小鼠肝脏组织及脂肪变性及脂质堆积的情况;应用免疫荧光法，标记肝巨噬细胞标记物F4/80，检测肝巨噬细胞聚集情况;利用蛋白质印迹法检测小鼠肝组织炎症、NLRP3炎症小体和自噬相关蛋白的表达情况;依据非酒精性脂肪性肝炎(NAS)评分系统，判定As2O3暴露后非酒精性脂肪性肝炎得发生;利用透射电子显微镜，检测并观察As2O3暴露后小鼠肝组织自噬小体的改变;用免疫荧光法，检测小鼠肝组织中caspase-1活化的情况。利用MTT法检测As2O3对HepG2细胞的细胞增殖率的影响;应用NLRP3炎症小体抑制剂MCC950，判定As2O3诱导的NLRP3炎症小体激活与As2O3导致的细胞焦亡及脂质堆积之间的关系;应用组织蛋白酶B(CTSB)抑制剂CA-074Me，确定CTSB在As2O3诱导NLRP3炎症小体激活及细胞焦亡当中的作用;应用自噬抑制剂3-MA，确定As2O3诱导的自噬与NLRP3炎症小体激活及细胞焦亡发生之间的关系;用牛磺酸预处理后，探究牛磺酸对于As2O3造成的非酒精性脂肪性肝炎的保护作用的分子机制。流式细胞术用于检测As2O3暴露后HepG2细胞焦亡数目变化;利用蛋白质印迹法检测炎症小体及自噬相关蛋白表达的变化;应用油红O染色法，观察As2O3暴露后HepG2细胞脂质堆积的情况。
　　结果:体内实验:HE及油红O染色结果表明，As2O3暴露后的小鼠肝脏发生脂肪变性，脂质聚集增加。肝巨噬细胞表面标记物F4/80免疫荧光染色及Western blot结果表明炎症相关蛋白表达水平随着As2O3暴露剂量的升高而升高。NAS评分表明4mg/L组小鼠肝脏发生非酒精性脂肪性肝炎。自噬相关蛋白LAMP-1、LC3及CTSB表达升高，p62表达水平降低，透射电镜结果发现As2O3暴露组出现明显自噬小体及自噬溶酶体，说明As2O3暴露后小鼠肝组织自噬过程被激活;炎症小体相关蛋白NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containinga CARD，ASC)及caspase-1蛋白表达均升高;肝组织切片active caspase-1荧光染色结果表明，小鼠肝细胞发生焦亡。牛磺酸干预组小鼠肝脏自噬水平、炎症水平、炎症小体激活情况及细胞焦亡情况均得到改善;NAS评分降低，但是脂肪变性及脂质堆积情况并未得到改善。体外实验:As2O3染毒后，HepG2细胞NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、caspase-1p20及IL-1βp17)表达升高;流式结果提示细胞焦亡百分比显著增加;应用NLRP3炎症小体抑制剂MCC950及CTSB抑制剂CA074Me处理后，As2O3引起的炎症小体激活被抑制，焦亡细胞百分比明显下降;应用自噬抑制3-MA处理后，CTSB及炎症小体相关蛋白表达明显降低，焦亡细胞百分比显著下降。牛磺酸干预后，HepG2细胞自噬相关蛋白、炎症小体相关蛋白表达均被抑制，焦亡细胞百分比明显减少。与体内实验相一致的是，无论是应用MCC950、CA074Me、3-MA处理还是牛磺酸干预后，脂质聚集增加的情况均未被改变。
　　结论:As2O3暴露后，脂肪变性及脂质聚集增加，同时诱导自噬水平上调，胞浆CTSB水平增加，进而激活NLRP3炎症小体，使得IL-1β成熟，细胞炎症水平增加，发生细胞焦亡，最终导致非酒精性脂肪性肝炎;牛磺酸主要通过抑制炎症水平而不是改善脂质聚集，从而缓解As2O3造成的非酒精性脂肪性肝炎。

目录

声明

摘要

(一)前言

(二)材料和方法

1．1 实验对象、药品和主要试剂

1．2 主要仪器

2．方法

2．1 实验动物饲养及处理

2．2 细胞培养和处理

2．3 细胞毒性检测

2．4 组织细胞中自噬小体观察

2．5 蛋白表达分析

2．6 肝脏巨噬细胞聚集检测

2．7 细胞内溶酶体及CTSB分布检测

2．8 脂质聚集检测

2．9 组织病理改变检测

2．10 非酒精性脂肪性肝炎评分

2．11 脂质相关基因表达分析

2．12 细胞焦亡的检测

2．13 统计分析

(三)结果

1．1 牛磺酸可以缓解三氧化二砷暴露导致的小鼠非酒精性脂肪性肝炎

1．2 牛磺酸抑制三氧化二砷诱导的自噬水平上调、NLRP3炎症小体激活以及细胞焦亡

2．体外实验部分

2．1．三氧化二砷导致肝细胞焦亡依赖于NLRP3炎症小体的激活

2．2．组织蛋白酶B介导三氧化二砷诱导的NLRP3炎症小体激活及细胞焦亡

2．3．三氧化二砷诱导的肝细胞自噬水平上调与胞浆组织蛋白酶B增加以及后续的NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡密切相关

2．4．牛磺酸通过抑制自噬-炎症小体通路缓解三氧化二砷诱导的肝细胞炎症及焦亡

(四)讨论

(五)结论

参考文献

三、综述 NOD样受体蛋白亚家族在非酒精性脂肪肝疾病进展中的作用研究进展

附录

五、攻读学位期间发表文章情况

致谢