去泛素化酶USP13在非小细胞肺癌中的表达与功能探究

摘要

随着发病率和死亡率的增加，癌症在中国成为主要致死原因。肺癌，作为死亡率第一，发病率第一的恶性癌症，被广泛研究，其主要分为非小细胞肺癌NSCLC(Non-Small Cell Lung Cancer)和小细胞肺癌SCLC(Small-Cell Lung Cancer)。NSCLC具有可手术切除困难，术后容易发生转移、复发，对放化疗不敏感等特点不容易进行传统治疗，深深困扰非小细胞肺癌患者。
　　针对NSCLC靶向药物研究越来越热门，分子靶向治疗中，去泛素化酶对NSCLC进行治疗也逐渐被探索。去泛素化酶有5个家族，其中USP(ubiquitin specific proteases)家族数量和种类最为庞大。其中去泛素化酶USP13(ubiquitin specific proteases13)作为一个热门的USP家族成员，2016到2018年在功能调控作用上被广泛研究，发表Natrue Communication5篇。其主要作用包括增强抗感染的免疫能力，调节DNA损伤修复，卵巢癌扩增异常表达和代谢调节，内质网相关降解作用，调控癌蛋白泛素化等。
　　目的:
　　本课题从USP13在不同癌种间的异常扩增角度入手，分析USP13在正常组织与肿瘤中的mRNA表达，探究USP13在NSCLC中异常扩增的本质。通过美国癌症研究数据库(TCGA，The Cancer GenomeAtlas)大数据分析USP13基因在NSCLC中的扩增和表达的关系，筛选可能与USP13存在潜在关系的蛋白，在细胞水平和动物水平探究USP13在NSCLC中的促瘤机制。
　　方法:
　　通过TCGA美国癌症研究数据库，探寻USP13所在的3号染色体基因组相关CNV(copy number variation)的变化;运用从UCSC将illuminaHiseq测序数据经过log2(RSEM+1)转化成cgData储存的三级数据，来分析肿瘤中USP13的mRNA表达水平，以及USP13相关系数高的基因，从而探寻USP13在NSCLC中的功能。
　　通过分子克隆的手段，给不同结构域的USP13带上GFP荧光标签，探究USP13结构域与定位的关系。
　　通过稳转基因沉默技术(sh-RNA)将USP13敲低，探究USP13在NSCLC细胞中的作用。
　　利用免疫缺陷小鼠，探究USP13在体内成瘤中的作用。
　　结果:
　　从USP13的mRNA表达来看，针对癌与癌旁的比较，发现USP13的mRNA表达量在肉瘤，前列腺癌和肠癌中，表达上调;在肺癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、子宫癌、胆管癌、甲状腺癌和肾癌中下调，其中肾癌下调最为显著。从USP13基因扩增来看，肺鳞癌中USP13基因拷贝子变化(CNV，copy number variation)最大，出现位居第一的扩增。通过分析TCGA肺鳞癌的扩增，以及mRNA水平的表达，发现，肺鳞癌USP13显著扩增是由于3号染色q臂有一段显著扩增区域，同时扩增区域CNV与mRNA表达成正相关。从临床病人蛋白水平来看，USP13在癌中表达略高于癌旁。USP13定位于细胞核和细胞质。
　　结论:
　　从功能来看，通过TCGA肺癌患者的测序数据，筛选与USP13相关性高的基因，筛选出与USP13有潜在关系的基因20个左右。通过GO分析，对这些基因进行功能和结构互作进行分析，发现USP13潜在的调控功能（肺腺癌可能和剪接相关，肺鳞癌可能和磷朊相关）。通过不同结构域的USP13细胞定位，发现去掉锌指结构域，USP13在细胞中成点状分布。在NSCLC细胞系中，利用基因沉默技术敲低USP13，发现USP13通过稳定磷酸化AKT促使细胞生长。抑制USP13的表达，裸鼠早期成瘤能力减弱。

目录

声明

摘要

(一)前言

(二)材料和方法

1．材料

1．1 主要仪器与设备

1．2 实验主要试剂

2．方法

2．1 细胞培养方法

2．2 细胞培养

2．3 名田胞计数

2．4 病毒包装

2．5 细胞平板克隆

2．6 免疫荧光

2．7 MTT法细胞生长曲线测定

2．8 组织样本制备

2．9 Western blotting

2．10 动物实验

2．11 TCGA数据分析

2．12 数据处理

(三)实验结果

1．USP13的表达

1．2 USP13在肿瘤中的表达

2．USP13功能研究

2．1 TCGA生物信息筛选USP13相关蛋白及可能存在的功能

2．2 USP13的细胞定位

2．3 细胞模型下，USP13在非小细胞肺癌中的促癌功能

2．4 裸鼠成瘤

(四)讨论

(五)结论

参考文献

去泛素化以及去泛素化酶在肿瘤发生发展中的作用 综述

致谢