益智仁中原儿茶酸对PC12细胞保护作用研究

摘要

本研究选用与多巴胺能神经元有许多相似特征的PC12细胞为实验对象，以过氧化氢(H2O2)、谷氨酸(Glu)、及1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)等神经毒素分别诱导细胞损伤，从而建立体外多巴胺能细胞的氧化应激模型。结果表明，以上三种毒素均可对多巴胺能的PC12细胞产生毒性作用，在一定浓度范围内其毒性作用呈剂量和时间依赖关系。在此基础上，选择H2O20.4mM(24h)、Glu10mM(48h)、及Mpp+1mM(48h)作为下一步实验的模型条件。 通过以上建立的损伤模型，对益智仁中的神经活性部位进行跟踪筛选。实验发现，益智仁的乙酸乙酯部位具有明显的抗氧化应激介导的保护作用；对其进一步分离纯化，最终得到一个活性单体化合物。采用光谱学技术(红外、紫外、核磁共振波谱和质谱)对得到的单体化合物进行结构解析，最后鉴定为一种酚类化合——3，4-羟基苯甲酸，即原儿茶酸(Protocatechuicacid，PCA)。PCA从益智仁中分离得到目前尚未见有文献报道。在0.06～1.2mM的剂量范围内，PCA对细胞具有一定的增殖作用，而且剂量依赖地保护了氧化应激所致的细胞死亡。通过比较在不同损伤模型中的半数有效剂量(IC50)发现，PCA对Mpp+介导的细胞损伤具有更加明显的保护作用，这个结果提示了PCA在不同毒素中的不同作用机制。 利用H2O2造成PC12细胞的直接氧化应激损伤，探讨PCA在神经细胞中的抗氧化机制。培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的测定与MTT的结果基本一致，PCA剂量依赖地减少了细胞中LDH的漏出；通过细胞核的形态观察以及流式细胞仪的分析，PCA可以减少H2O2介导的PC12细胞凋亡性死亡；PCA抗H2O2氧化应激损伤的保护作用与细胞内GSH水平的提高及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的激活相关，虽然谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性并没有显著变化；另外，H2O2和Fe2+可以通过Fenton反应产生羟自由基(·OH)，而PCA同样显著减弱了H2O2/Fe2+所致的细胞损伤。这些结果表明了在受活性氧(ROS)介导的氧化应激损伤时，PCA可以有效的保持PC12细胞内的抗氧化防御体系处于正常的水平，从而抑制细胞的功能衰竭而死亡。 利用Mpp+介导的PC12细胞间接氧化应激损伤，探讨PCA在神经细胞中的抗凋亡机制。LDH分析证明了PCA能够保护质膜的完整性而抑制Mpp+介导的LDH漏出；同样形态观察及流式细胞仪的分析，证实PCA可显著抑制Mpp+介导的细胞凋亡；而且，实验还采用AnnexinV-PI双染的方法分析检测了细胞凋亡和坏死的比率，PCA能够剂量依赖地降低凋亡/坏死细胞的比例；PCA抑制Mpp+介导的细胞凋亡可通过阻止膜电位(MMP)的丧失，抑制ROS的产生，减少GSH的耗竭，促进SOD和CAT的激活及拮抗caspase-3的活性和上调Bcl-2蛋白的表达。这些结果表明了PCA可能是通过调节线粒体的通透性而抑制氧化应激所致的细胞凋亡。 总之，本研究的结果表明，PCA是益智仁中的主要活性成分之一，有可能在氧化应激介导的神经退行性疾病(如PD)的预防及治疗中发挥重要作用。

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引 言

1.文献综述

2.多巴胺能PC12细胞的氧化应激损伤模型的建立

3.神经活性成分PCA的分离及鉴定

4.PCA对H2O2损伤PC12细胞的保护作用

5.PCA对Mpp+介导的PC12细胞凋亡的保护作用

6.结论与展望

参考文献

攻读博士学位期间发表学术论文情况

创新点摘要

致 谢