钩藤复方对肾性高血压大鼠血管重塑的影响及机制研究

摘要

目的：
　　 1．通过应用钩藤中药复方对肾性高血压大鼠模型的干预，研究钩藤复方对肾性高血压大鼠血压和血浆内皮素-1（ET-1）、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、一氧化氮（NO）的影响，以及对动脉组织一氧化氮合酶（eNOS）表达的影响，探讨钩藤复方的降血压机制。
　　 2．通过研究钩藤复方对肾性高血压大鼠主动脉壁形态学及VSMC超微结构的改变和动脉组织中Ⅰ型胶原（CICF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、骨桥蛋白（OPN）含量以及bFGF、OPN mRNA表达的影响，探讨钩藤复方抑制高血压血管重塑的机制。
　　 3．通过对高血压的致病机理的研究，结合中医药学相关理论，在细胞、分子、基因水平上揭示钩藤复方中药对缓解高血压症状、改善和抑制高血压的血管重塑及调节心血管系统功能方面的生理学作用机制，为筛选最佳临床治疗方案提供实验依据。
　　 材料与方法：
　　 1．实验药品
　　 （1）钩藤、天麻、黄芪、丹参、决明子、白芍、牛膝、桑叶。生药材经过再次干燥，按处方比例混合均匀，于常温下加入蒸馏水浸泡1小时；文火煎煮三次，每次煎煮时间为1小时；将过滤后的滤出液混合并浓缩，制成每毫升含生药2克的浓缩液，-4℃冰箱保存。
　　 （2）牛黄降压丸：1.6克/丸。以蒸馏水配制成0.2克/毫升的药液，供大鼠灌胃使用。
　　 （3）卡托普利（CAP）：25毫克/片。以蒸馏水配制成2.5毫克/毫升的药液，供大鼠灌胃使用。
　　 2．实验动物:本实验采用Goldblatt经典肾性高血压大鼠模型并加以改进，建立“两肾一夹”肾性高血压大鼠模型（RHR）。
　　 3．分组:实验动物模型分为6组，每组10只：空白对照组、模型组、钩藤高剂量组、钩藤低剂量组、中药对照组、西药对照组。
　　 4．方法:钩藤高剂量组给与20g生药/kg/d，低剂量组6.6g生药/kg/d，西药对照组7.5 mg/Kg/d，中药对照组0．96g/kg/d，空白对照组及模型组均给予1ml/100g的蒸馏水灌胃。每日上午给药一次，持续12周。最后一次给药后24小时禁食，不禁水。用10％水合氯醛，按0.4ml/100g的剂量腹腔注射麻醉动物后取材。
　　 5．研究内容
　　 （1）肾性高血压模型的建立与评价；（2）钩藤复方对肾性高血压大鼠血压的影响；（3）钩藤复方对肾性高血压大鼠血浆ET-1、NO、AngⅡ水平的影响；（4）主动脉壁病理学观察，形态学指标：主动脉中膜厚度（MT）、中膜胶原面积检测及VSMC超微结构观察；（6）应用酶联免疫法（Elisa）测定肾性高血压大鼠动脉组织中CICF、eNOS、bFGF、OPN含量；（7） RT-PCR法检测肾性高血压大鼠主动脉壁bFGF、OPN mRNA表达。
　　 结果：
　　 1．肾性高血压模型的建立与评价:与空白对照组比较，手术组即左侧肾动脉部分狭窄后，“两肾一夹”高血压大鼠模型在3天内收缩压开始出现升高，7天后血压急剧上升，14天高血压已初步形成，28天时动脉收缩压由术前的（101．80±4.18） mmHg上升到（152．32±4.53） mmHg，具有显著性差异。
　　 2．钩藤复方对RHR大鼠血压及血中AngⅡ、ET-1、NO含量、动脉组织eNOS活性的影响
　　 （1）钩藤复方对肾性RH大鼠血压的影响:经过连续药物干预，治疗后第3周开始，西药对照组首先出现血压降低，与模型组和治疗前相比有显著性差异，其后呈逐渐显著下降趋势。其他治疗组从第6周开始出现持续性血压降低，其中钩藤高剂量组与治疗前和模型组比较有显著差异，治疗9周后钩藤复方低剂量组、中药对照组出现显著血压下降。
　　 （2）血浆中AngⅡ含量的比较:与空白对照组大鼠相比，模型组大鼠血浆AngⅡ浓度明显升高，具有显著差异。除西药对照组外，各给药组大鼠血浆AngⅡ浓度均有显著升高。各给药组大鼠除钩藤低剂量组外血浆AngⅡ浓度均低于模型组，有统计学差异。西药对照组血浆AngⅡ浓度均高于其它给药组，且显著高于低剂量组。
　　 （3）血浆中ET-1含量的比较:与空白对照组相比，模型组和西药对照组大鼠血浆ET-1浓度明显增加。除西药对照组外，各治疗组大鼠血浆ET-1浓度较模型组均有显著下降，其中高剂量组下降最为显著，其次为低剂量组、中药对照组。高剂量组与西药对照组相比，血浆ET-1浓度也明显降低。
　　 （4）血清NO含量的比较:与空白对照组比较，模型组大鼠血清NO含量明显低于空白对照组大鼠，差异有统计学意义。各治疗组大鼠血浆NO含量与模型组比较均有升高，其中高剂量组升高最为显著，其次为低剂量组、中药对照组，西药对照组与模型组比较虽有升高但无显著性差异。高剂量组与西药对照组相比，差异具有统计学意义。
　　 （5）动脉组织中eNOS活性的比较:与空白对照组比较，模型组大鼠主动脉eNOS活性明显低于空白对照组大鼠，差异有统计学意义。各治疗组大鼠eNOS活性与模型组比较均有显著升高。西药对照组与模型组比较虽有升高但无显著性差异。钩藤高剂量组与西药对照组相比，差异具有统计学意义。
　　 3．钩藤复方对肾性高血压大鼠动脉壁形态学、超微结构及CICF的影响
　　 （1）光镜下主动脉形态学观察:HE染色切片显示：模型组与空白对照组相比血管中膜厚度（MT）显著升高。与模型组相比，各给药组主动脉中膜厚度均有所降低，高剂量组和西药对照组中膜厚度降低最显著。但各治疗组间差异无显著性。
　　 （2）光镜下Masson染色观察:染色结果：大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）经Masson染色为淡粉色，细胞间质成分染色纹理界限清晰的浅绿色。分组光镜结果显示：空白对照组大鼠管壁间质成分较少呈均质状，血管中膜胶原纤维排列整齐连续、层次清晰。模型组大鼠与空白对照组比较可见有明显的间质成分增多，血管壁平滑肌层明显增生紊乱，间质增多，胶原纤维排列紊乱，表现为间隙加大、过度迂曲、层次混乱、局部出现断裂。与模型组相比，各给药组动脉管壁间质成分则有不同程度下降，中膜胶原纤维排列亦较规整。
　　 （3）主动脉中膜胶原面积百分比（VFC）的比较:模型组大鼠与空白对照组比较，主动脉壁中膜胶原面积百分比显著升高。与模型组相比，各给药组主动脉中膜胶原面积百分比显著减少,其中高剂量组和低剂量组减少最为显著。
　　 （4）主动脉壁平滑肌细胞超微结构的观察:透射电镜观察显示：空白对照组大鼠主动脉管壁中膜平滑肌细胞膜结构完整，细胞核的形态较规则，线粒体数量较少，无变形，嵴规整。模型组大鼠主动脉VSMC异常增大，局部线粒体数量明显增多、个体肿大、基质密度下降，嵴数量减少、移位、局部出现空泡，细胞核变形明显，呈不规则状，密度不均匀，染色质靠近核内膜呈不规则分布，局部核质固缩。其他治疗组大鼠主动脉中膜平滑肌细胞形态均有不同程度好转，与模型组相比，线粒体数量明显减少，形态也较规则，细胞核染色质均匀分布。
　　 （5）主动脉组织中C1CF含量的比较:与空白对照组大鼠相比，模型组大鼠血管壁C1CF含量明显升高。与模型组大鼠相比，各给药组C1CF含量均显著下降，其中高剂量组下降最为显著，依次为低剂量组、中药对照组和西药对照组。各给药间无显著性差异。
　　 4．钩藤复方对RHR大鼠动脉组织中bFGF、OPN含量及mRNA表达的影响
　　 （1）主动脉组织中bFGF含量的比较:与空白对照组大鼠相比，模型组大鼠血管壁bFGF含量明显升高；实验后与模型组大鼠相比，各给药组bFGF含量均有显著下降；高剂量组下降最为显著，接近空白对照组，但仍有统计学差异；中药对照组与高剂量组比较亦有显著差异。
　　 （2）主动脉组织中OPN含量的比较:与空白对照组大鼠相比，模型组大鼠血管壁OPN含量明显升高。与模型组大鼠相比，实验各组OPN含量均有显著下降，高剂量组OPN蛋白含量下降最为显著；中药对照组及西药对照组与高剂量组和低剂量组比较均有显著差异。
　　 （3）动脉组织中bFGF mRNA表达的比较:模型组大鼠血管壁bFGF mRNA表达显著高于空白对照组。高、低剂量组bFGF mRNA表达与模型组比较显著下降；中药对照组、西药对照组与模型组相比也有显著性差异；中药对照组及西药对照组mRNA表达与高剂量组比较有显著差异。
　　 （4）动脉组织中OPN mRNA表达的比较:模型组大鼠血管壁OPNmRNA表达显著高于空白对照组。高、低剂量组OPN mRNA表达与模型组比较显著下降，中药对照组、西药对照组与模型组相比也有显著性差异；中药对照组及西药对照组mRNA表达与高剂量组比较有显著差异。
　　 结论：
　　 1．钩藤复方对肾性高血压大鼠模型具有显著的降压疗效，其降压机制可能是通过降低肾性高血压大鼠血浆AngⅡ、ET-1水平，升高NO的水平及血管内皮eNOS的表达，从而改善肾性高血压大鼠的病理体质而发挥药效，亦说明钩藤复方中药组方的合理性。
　　 2．钩藤复方中药能够改善肾性高血压大鼠主动脉中膜VSMC增殖、迁移改变。其机制与钩藤复方中药抑制bFGF和OPN对VSMC表型转化的促进作用有关。
　　 3．钩藤复方中药能明显改善肾性高血压大鼠主动脉壁形态学指标，降低主动脉中膜胶原含量，对肾性高血压大鼠主动脉血管重塑进程有明显的抑制作用，其机制与钩藤复方中药抑制主动脉壁bFGF与OPN mRNA和蛋白表达有关。