丹酚酸B的降解机理及纯化工艺研究

摘要

丹参是唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge．)的干燥根及根茎，是一味传统中药，《中华人民共和国药典》(2005版) 记载丹参具有“祛瘀止痛，活血通经、清心除烦”等功效。丹酚酸B是丹参中含量最高的酚酸成分，有很强的生物活性，特别是在抗氧化、清除自由基方面具有很高的药用价值。但丹酚酸 B 不稳定，易降解，不仅降低制剂的临床疗效，也给丹酚酸 B 的临床应用带来安全隐患，已成为丹酚酸 B 产业化的瓶颈。本文以反应动力学和热力学为理论基础，运用HPLC、LC-MS和NMR等现代分析手段，系统研究了丹酚酸 B 的降解动力学特征和降解机理。在此基础上，对丹酚酸 B 的提取纯化工艺进行初步探索和优化。 首先，研究了丹酚酸的降解现象，并利用 LC-MS 对其中 11 种成分进行鉴定。实验结果表明，在加热过程中丹酚酸含量随加热时间延长不断变化，主要规律是丹酚酸 A、B、E 等缩合酚酸含量不断减少，丹参素、原儿茶醛、咖啡酸等含量不断增加，紫草酸及其同分异构体的含量先增加后减少，表现为中间产物的动力学行为。pH 是影响缩合酚酸降解的主要因素，在 pH2.0-3.0 时缩合酚酸较为稳定，在其它 pH 条件下，缩合酚酸的降解速率明显增大，多酚酸相似的稳定性趋势是由相近的化学结构决定的。 其次，研究了缓冲盐浓度、溶液的 pH、温度等对丹酚酸 B 降解的影响。实验结果表明，丹酚酸B降解符合一级动力学特征，降解速率随缓冲盐浓度的增加而线性增大。pH-速率图是“S”型曲线，在pH2.0时最为稳定；当 pH<2.0 时，丹酚酸 B 降解速率随 pH减小而加快，表明主要受到 H<+>催化作用；当 pH2.0-7.0 时，丹酚酸 B 降解速率随 pH 增大而加快，表明受 OH<'->催化作用。丹酚酸 B 的降解速率随温度升高而加快，Arrhenius公式拟合结果表明，在 pH2.0-4.0 条件下，丹酚酸 B 降解活化能是40-85kJ/mol，处在酯水解能量范围内。 再次，用 HPLC 制备了丹酚酸 B 的降解产物并进行了结构鉴定，得出了丹酚酸 B的降解机理。<'1>H(<'13>C)-NMR 鉴定结果表明，丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、紫草酸和丹酚酸 E 是丹酚酸 B 的主要降解产物。丹酚酸 B 主要降解途径是酯水解和苯并呋喃开环，其中丹参素、紫草酸是水解产物，原儿茶醛是氧化产物，丹酚酸 E 是苯并呋喃开环产物。 在此基础上，研究了微波干燥丹参鲜药材和丹酚酸B的提取、纯化工艺。 首先，以丹酚酸 B 的溶出速率为指标，首次考察了微波干燥丹参鲜药材结合冷浸提取提取丹酚酸 B 的工艺。结果表明，微波干燥的最佳功率为 650W，与晒干药材相比，微波干燥药材中丹酚酸 B 的溶出速率可提高 117％，并获得较高的提取率。 其次，以丹酚酸 B 的回收率和分配系数为指标，考察了不同乙醇/硫酸铵双水相体系的萃取效果。结果表明，分配系数和回收率均随硫酸铵和乙醇质量分数的增大而增大，随 pH 增大先增大后减小。在 pH2.0 的粗提液中，当硫酸铵和乙醇的质量分数分别为25％和 20％时，分配系数为 95.58，回收率为 97.93％，证明双水相萃取丹酚酸 B 是可行的。 再次，用吸附动力学和热力学方法研究了聚酰胺树脂对丹酚酸 B 的吸附特性，对影响吸附的因素，如丹酚酸B的初始浓度、平衡时间、吸附溶液的 pH、温度等进行了考察。实验结果表明，聚酰胺树脂对丹酚酸 B 的吸附等温线符合 Langmuir 吸附等温线，在初始浓度分别为0.16、0.43、2.66mg/mL 时，聚酰胺树脂对丹酚酸 B 的吸附量分别为69、196、376mg/g。丹酚酸 B 在聚酰胺树脂上的吸附过程符合二级吸附动力学特征。pH显著影响丹酚酸 B 的吸附量，当 pH<3 时，为高吸附量区，35 时，为低吸附量区。这种吸附行为表明氢键和静电吸附是产生吸附的主要作用。吸附热力学研究表明，聚酰胺树脂对丹酚酸 B 的吸附是一个放热过程，△H=-50.0kJ/mol；是一个熵减少过程，△S=-147.3J/mol；是一个自发过程，在25，30，35，45℃时，Gibbs 自由能(△G)分别为-6.17，-5.40，-4.64 和-3.22kJ/mol，Gibbs 自由能随温度升高而减小，表明升高温度不利于吸附的进行。 最后，研究了聚酰胺树脂为介质纯化丹酚酸 B 的柱层析工艺，对影响层析效果的主要因素，如聚酰胺树脂粒度、药液的 pH、药液浓度和流速等进行了优化。实验结果表明，如果以大颗粒聚酰胺树脂 (60-100 目) 为介质，最佳流速是 1mL/min，药液浓度是2.4mg/mL，pH为2.0，以3倍柱体积 (3BV) 水除杂、以1BV 20％和5BV 70％乙醇洗脱，收集70％洗脱液，浓缩除醇，冷冻干燥，得含量为 53.53％的丹酚酸B，收率为 83.00％，对药材收率为 2.29％左右。如果以小颗粒聚酰胺树脂 (100-200 目) 为介质，流速为0.5mL/min，以 3BV 水除杂，以 1BV 20％、1.5 BV 50％和 1.5-4BV 70％乙醇洗脱，收集含丹酚酸B的70％洗脱液，浓缩除醇，冷冻干燥，得含量大于95％的丹酚酸B，收率为30％。 总之，本研究结果表明，丹酚酸 B 的酯水解和苯并呋喃开环是丹酚酸 B 降解的主要途径，温度和 pH 是影响丹酚酸 B 稳定的主要因素；微波干燥丹参鲜药材与冷浸提取相结合，可加快丹酚酸 B 的溶出速率，双水相萃取与聚酰胺树脂层析相结合可实现对丹酚酸 B 的纯化。本研究为丹酚酸 B 的药用开发提供了科学依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

1丹参化学成分研究进展

1.1我国丹参种类和分布

1.2丹参化学成分及药理作用

1.2.1脂溶性成分及药理作用

1.2.2水溶性成分及药理作用

1.3丹酚酸的分析与鉴定方法

1.3.1薄层层析法

1.3.2分光光度法

1.3.3高效液相色谱法

1.3.4 LC-MS在丹酚酸分析与鉴定中的应用

1.4丹酚酸提取与纯化技术

1.4.1丹参总酚酸提取与纯化技术

1.4.2丹酚酸B提取与纯化技术

1.5药物稳定性研究方法

1.5.1药物稳定性研究的方法及其影响因素

1.5.2丹酚酸B稳定性研究现状

1.6天然产物分离技术研究进展

1.6.1微波技术在天然产物提取中的应用

1.6.2双水相萃取在天然产物分离中的应用

1.6.3聚酰胺树脂层析在天然产物纯化中的应用

1.7本课题研究内容、方案与意义

1.7.1本课题研究目标

1.7.2本课题研究方案

1.7.3本课题的意义

2丹参粗提物的稳定性

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1主要仪器与试剂

2.2.2丹参总酚酸的分析与鉴定方法

2.2.3丹参总酚酸的高温降解实验

2.3结果与讨论

2.3.1丹酚酸降解现象

2.3.2 LC-MS鉴定多酚酸

2.3.3丹酚酸反应动力学

2.4小结

3丹酚酸B降解动力学

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1主要仪器与试剂

3.2.2丹酚酸B的分析方法

3.2.3丹酚酸B的降解实验

3.3结果与讨论

3.3.1丹酚酸B的降解动力学特征

3.3.2缓冲盐浓度对反应速率的影响

3.3.3 pH对反应速率的影响

3.3.4温度对反应速率的影响

3.4小结

4丹酚酸B的降解机理

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1主要仪器与试剂

4.2.2实验方法

4.3结果与讨论

4.3.1丹酚酸B的制备与鉴定

4.3.2丹酚酸B降解产物的制备与鉴定

4.3.3丹酚酸B降解机理

4.4小结

5丹参鲜药材的微波干燥与低温浸取工艺

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1主要仪器与试剂

5.2.2丹酚酸B的分析方法

5.2.3实验方法

5.3结果与讨论

5.3.1提取剂的选择

5.3.2微波干燥药材对丹酚酸B的影响

5.3.3微波辅助提取

5.4小结

6丹酚酸B的双水相萃取工艺

6.1引言

6.2材料与方法

6.2.1主要仪器与试剂

6.2.2实验方法

6.3结果与讨论

6.3.1乙醇质量分数的影响

6.3.2硫酸铵质量分数的影响

6.3.3 pH的影响

6.3.4丹参粗提液的双水相萃取效果

6.4小结

7丹酚酸B在聚酰胺树脂上的吸附行为与纯化工艺

7.1引言

7.2材料与方法

7.2.1主要仪器与试剂

7.2.2丹酚酸B的分析方法

7.2.3实验方法

7.3结果与讨论

7.3.1聚酰胺树脂的吸附特性

7.3.2耦合双水相萃取和聚酰胺树脂纯化工艺

7.3.3丹酚酸B的精制

7.4小结

结论与展望

创新点摘要

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表学术论文情况

致谢