乳岩宁方诱导MCF-7细胞凋亡及抑制荷瘤裸鼠微血管生成作用的实验研究

摘要

目的：MCF-7是人源乳腺癌细胞，ER、PR、VEGF均阳性表达，本实验分为两部分，通过体外实验观察乳岩宁方对MCF-7细胞凋亡的影响，通过体内实验观察乳岩宁方对MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌的抑瘤作用、抑制MCF-7荷瘤裸鼠肿瘤血管生成及对磷酸化Akt蛋白表达水平的影响，来探讨乳岩宁方的作用机制，可能与PI3K/Akt信号转导通路相关。
　　 材料与方法：实验细胞株：MCF-7购于湖南湘雅医学院中心实验室细胞库（美国标准生物品收藏中心ATCC制备）。实验动物：SPF级小鼠（4-6周龄）50只雌雄各半，体重20±2 g；雌性BALB/c-nu/nu裸鼠（4-6周龄）30只，体重20±2 g购于大连医科大学实验动物中心实验动物质量合证：SCXKGGD2004-0017。实验方法：一、含乳岩宁方SPF小鼠血清制备：50只SPF级小鼠适应性喂养3天，随机分为对照组、用药组，用药组按人与小鼠体表面积比值折算成相当于人临床剂量10倍量给药，对照组灌服等体积生理盐水，于每天上、下午相同时间（每次间隔12小时）灌胃，连续灌胃7天，后禁食不禁水，于未次给药2次，中间间隔1h，于最后一次给药后1小时，无菌操作下取血。血样常温放置4小时后4℃过夜，离心2000rpm×15min，0.22um微孔滤膜过滤分装于EP管中，-20℃保存，使用前56℃水浴灭活30min。二、MTT比色法测定乳岩宁含药血清对MCF-7细胞增殖的影响实验步骤:1将对数生长期的细胞以0.25％的消化胰酶/EDTA800ul消化，用10％FBS的DMEM制成单细胞悬液；2调整细胞浓度为2×105/ml，接种于3块96孔板中，每孔200ul，于37℃，5％CO2饱和湿度条件培养24 h；3换用0.5％FBS的DMEM培养基，继续于37℃，5％CO2饱和湿度条件培养24 h，同步细胞于G0/G1期；4根据DMEM培养基中血清来源不同将细胞随机分为6组，即5％正常血清组、10％正常血清组、20％正常血清组及相同体积分数的5％中药血清组、10％中药血清组、20％中药血清组，每组设10个复孔；5每孔分别添加各组不同体积分数血清及DMEM培养基，每孔终体积为200ul，继续分别培养24 h、48 h、72 h；6在不同的终点时间均换成无血清DMEM100ul，并加入MTT（5mg/ml）20uL，孵育4 h后，吸弃培养液，然后加入二甲基亚砜（DMSO）150uL/孔，放于水平摇床轻微震荡10 min；7用酶标仪在490nm波长处测定吸光度（OD值），结果取均值；计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100％。三、AO/EB荧光染色法观察乳岩宁对MCF-7细胞凋亡的影响取对数生长期MCF-7细胞，PBS液沈涤1次，0.25％胰酶/EDTA800ul消化后，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液配成104个/ml的细胞悬液。以每孔2ml体积接种于6孔板，孔内放玻片。细胞培养生长抑制2天后，分为乳岩宁含药血清浓度为5％、10％、20％、及对照组共4组，每组3个复孔，每组给药24h。1天后，吸去培养液，取出6孔板的玻片，PBS洗3次后，10％甲醛固定30分钟，AO/EB染色，碳酸盐缓冲甘油封片，荧光显微镜观察，激发波长为405 nm。每组分别计数3次，每次计数细胞300个，计算凋亡率，用SPSS10.0软件X2检验进行统计分析，确定影响凋亡的含药血清浓度。含药血清浓度为20％组，凋亡率最高，因此以下实验选择用20％浓度含药血清进行实验。四、流式细胞仪检测MCF-7细胞周期。五、乳岩宁对MCF-7细胞BAX/BCL2/Caspase3蛋白表达的影响取对数生长期的MCF-7细胞，用0.25％胰酶/EDTA800ul消化后，配成104个/ml的细胞悬液，以每瓶5ml体积接种于培养瓶中，每2天换液一次。在含有10％胎牛血清低糖DMEM培养基中培养，待其生长至70％融合时，换用0.5％FBS的DMEM培养基继续培养24 h，同步细胞于G0/G1期。将细胞分为对照组（含20％空白血清）和中药血清组（含20％中药血清），培养24 h，1天后，倒去培养液。将细胞培养液吸弃，预冷PBS洗细胞2次，倒出PBS，加入预冷的细胞裂解液，置冰上裂解细胞；细胞样品完全破碎后，用细胞刮刮下细胞，移至准备好的1.5ml的EP管中。冷冻高速离心机中离心，4℃1500转/min离心20分钟，取上清，即是蛋白。用Western blot的方法进行检测。六、乳岩宁含药血清诱导MCF-7细胞凋亡相关信号转导机制Westernblot检测P-AKT蛋白表达取对数生长期平滑肌细胞，用PBS液洗涤1次，用0.25％胰酶/EDTA800ul消化后，制成单细胞悬液，以每瓶5ml体积接种于培养瓶中，于37℃，5％CO2条件下培养；待其生长至70％融合时，换用0.5％FBS的DMEM培养基继续培养24 h，同步细胞于G0/G1期；将细胞分为正常血清组（含20％空白血清）和中药血清组（含20％中药血清），培养24 h；在终点时间，更换含有PDGF-BB（5ng/ml）的培养基继续孵育30min；分别于5min、10min、20min、30min将细胞培养基吸弃，细胞刮收集细胞，后续Western blot检测。七、以及MCF-7荷瘤裸鼠病理切片制备、透射电镜观察细胞凋亡微观状态、免疫组化检测细胞凋亡原位杂交（TUNEL）法、MVD表达、ELISA方法检测MCF-7荷瘤裸鼠血清中EGF/VEGF表达，以及Western blot法对PI3K-Akt蛋白检测等。
　　 结果：
　　 1.MTT检测提示乳岩宁20％含药血清干预24小时对MCF-7有明显抑制作用。流式细胞仪凋亡检测试剂盒（AnnexinV-FITC）检测提示乳岩宁含药血清可诱导MCF-7细胞凋亡。
　　 2.流式细胞仪细胞周期检测提示乳岩宁含药血清诱导MCF-7细胞停滞于G0/G1 S期，且呈量效关系。
　　 3.蛋白检测乳岩宁含药血清可下调BCL-2蛋白表达，提高Bax及Caspase3蛋白表达，降低Bcl-2/Bax比值，下调P-Akt表达，说明乳岩宁含药血清诱导MCF-7细胞凋亡机制之一是通过影响PI3K/Akt通路中磷酸化Akt蛋白表达水平，进而干预细胞周期相关调控蛋白的表达实现。
　　 4.MCF-7荷瘤裸鼠在体实验病理、电镜形态学观察细胞凋亡微观状态，免疫组化检测细胞凋亡原位杂交（TUNEL）法、蛋白检测P-Akt弱表达，印证乳岩宁方对MCF-7荷瘤裸鼠亦具有诱导细胞凋亡作用。
　　 5.乳岩宁方分组干预后免疫组化检测MCF-7荷瘤裸鼠MVD下降、ELISA方法检测MCF-7荷瘤裸鼠血清中EGF/VEGF表达下调，说明乳岩宁方具有抑制乳腺癌血管生成作用，对MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌具有多靶点治疗作用。
　　 结论：
　　 1.乳岩宁方对MCF-7细胞及MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌具有诱导细胞凋亡作用。诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制与PI3K/Akt信号转导通路相关。
　　 2.乳岩宁方具有抗MCF-7荷瘤裸鼠乳腺癌血管生成作用。