白眉蝮蛇蛇毒磷脂酶A的神经毒活性研究

摘要

用阳离子交换和凝胶过滤层析，从长白山白眉蝮蛇(Gloydius ussurensis)蛇毒中分离得到磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)的同源物，SDS-PAGE检测为一条单带，质谱检测分子量为13880.789；该蛋白49位氨基酸残基为Gln，命名为GIn49-PLA2，具有肌肉毒性，神经毒性，但缺乏磷脂酶A2活性。 GIn49-PLA2能够剂量依赖性地抑制颈二腹肌神经信号正常传导并影响肌肉收缩，在100ug/ml剂量下，肌肉收缩幅度在150分钟后达到50％的抑制率；同时，随着GIn49-PIA2浓度的降低，肌肉收缩幅度的抑制效率也逐渐降低；实验证明GIn49-PLA2对突触后膜乙酰胆碱受体敏感性无影响，对神经肌肉信号传导收缩的抑制作用位点在突触前膜。 Gln49-PLA2对小鼠坐骨神经动作电位幅度和传导速度的作用研究表明：Gln49-PLA2能浓度依赖性的抑制小鼠坐骨神经复合动作电位幅度和传导速度，在100ug/ml剂量下，Gln49-PLA2在作用40分钟后完全抑制坐骨神经标本动作电位与传导速度同时使其神经传导活性消失。 Gln49-PLA2缺乏磷脂酶A2活性，但是在≥50ug/ml浓度下却表现一定出的肌肉毒性作用：肌酸激酶活性检测表明，在50-100ug/ml范围内，随着浓度增长肌酸激酶活性逐渐增加；同时染色切片标本观察显示Gin49-PLA2在100ug/ml浓度时，对肌肉组织细胞的损伤数量百分比达到30.7％。 采用膜片钳技术，分析Gln49-PLA2神经毒性对大鼠海马神经元细胞表面离子通道电流的影响，结果表明：Gin49-PLA2在20ug/ml浓度下，显著抑制钾通道正常去极化，抑制钾电流峰值45.75％;同时促进钠通道开放，增加钠电流峰值到158.99％，明显降低神经细胞兴奋性。 综上所述，Gln49-PLA2引起神经细胞电兴奋性降低，神经组织信号传导被明显抑制，通过神经细胞电压依赖型离子通道阻滞传递神经信号的动作电位产生，研究结果证实GIn49-PLA2是一种新的突触前神经毒素。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

1 综述

1.1概述

1.2蛇毒神经毒素的结构性质和作用机理

1.2.1突触后神经毒素

1.2.2突触前神经毒素

1.2.3蛇毒神经毒素的作用机理

1.3蛇毒神经毒素的镇痛机制研究

1.3.1镇痛作用与痛觉调控相关方面的关系

1.4离子通道

1.4.1离子通道的分类

1.4.2离子通道的研究方法

1.5蛇毒磷脂酶A2的研究

1.5.1磷脂酶A2的一般性质

1.5.2磷脂酶A2的分类

1.5.3蛇毒磷脂酶A2的结构特征

1.5.4蛇毒磷脂酶A2的生物学功能

1.5.5蛇毒PLA2的药理作用的机制

1.6蛇毒神经毒素的临床应用

1.7展望

2本课题研究的目的和意义

3蛇毒磷脂酶A2(Gln49-PLA2)的分离纯化

3.1实验材料及仪器

3.1.1实验材料

3.1.2实验仪器

3.2实验方法

3.2.1白眉蝮蛇蛇毒Gln49-PLA2的制备

3.2.2蛋白浓度的确定

3.2.3纯化蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.3实验结果

3.3.1阳离子交换层析

3.3.2凝胶过滤层析

3.3.3蛋白电泳检测

3.3.4 Gln49-PLA2分子量的确定

3.3.5 Gln49-PLA2的定量

3.4 小结

4 Gln49-PLA2的神经及肌肉毒性

4.1实验材料

4.1.1实验动物

4.1.2实验药品

4.1.3实验仪器

4.2实验方法

4.2.1动作电位与传导速度测量

4.2.2神经肌肉传导实验

4.2.3肌肉毒性的测定

4.3结果与讨论

4.3.1动作电位与传导速度的变化

4.3.2 Gln49-PLA2对鸡颈二腹肌神经肌肉接点传递的阻滞作用

4.3.3 Gln49-PLA2对颈二腹肌乙酰胆碱敏感性的影响

4.3.4肌肉收缩基线上升

4.3.5肌肉毒活性

4.3.6形态学观察

4.4小结

5 Gln49-PLA2对离子通道的作用

5.1实验材料

5.1.1实验动物

5.1.2主要药品与试剂

5.1.3主要仪器和材料

5.2实验方法

5.2.1海马神经元的急性分离

5.2.2形态学观察

5.2.3全细胞膜片钳记录

5.2.4实验数据的处理

5.3实验结果

5.3.1急性分离海马神经元形态学观察

5.3.2 Gln49-PLA2对电压门控性钠通道电生理学特性的影响

5.3.3 Gln49-PLA2对电压门控性钾通道电生理学特性的影响

5.4讨论

5.5 小结

结论

创新点

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢