盐角草SeCMO、SePEAMT基因在大肠杆菌中的表达及转双基因烟草耐旱性研究

摘要

在干旱、盐碱等逆境条件下植物体内可积累大量的甜菜碱，甜菜碱的积累对改善渗透调节、保护细胞膜具有重要作用，因此甜菜碱被认为是很有效的渗调剂之一。胆碱单加氧酶(CMO)和磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)是高等植物甜菜碱合成途径中的两个关键酶。利用基因工程技术，把与甜菜碱合成相关的基因导入植物，使其积累甜菜碱，将有可能达到增强植物抗旱性的目的。 为了制备CMO、PEAMT抗体，我们将盐角草SeCMO，SePEAMT基因分别连接到表达质粒pGEX-6p1中，得到重组质粒pGEX6p1-SeCMO和pGEX6p1-SePEAMT，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，SDS-PAGE分析，显示SeCMO、SePEAMT基因能够在大肠杆菌中大量表达，通过GST亲和层析纯化，获得了较纯的融合蛋白。 为评价转基因烟草的耐旱性，以野生型烟草、转SeCMO烟草及转SePEAMT+SeCMO烟草为材料，进行自然停水干旱处理，测定甜菜碱含量、相对含水量、光合参数、质膜损伤、活性氧代谢、主要渗透调节物质含量等生理生化指标。结果显示：干旱胁迫后，转基因烟草甜菜碱含量显著高于野生型烟草，并能维持较高的相对含水量。干旱胁迫后，所有株系的净光合速率、气孔导度均下降，转双基因株系PC26、PC45仍具有显著高于野生型烟草的净光合速率，且胞间CO2浓度低于对照，表明其光合系统损伤较轻。此外，转双基因株系的细胞膜离子渗透率和丙二醛含量显著低于野生型，且SOD活性、POD活性、可溶性糖含量、游离脯氨酸含量、可溶性蛋白含量普遍高于野生型烟草。以上结果表明：转基因烟草中高水平甜菜碱的积累，能通过渗透调节、保护细胞膜及代谢酶类稳定性的作用，提高烟草的耐旱性。

目录

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英文文摘

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引 言

1 文献综述

1.1植物的耐旱机制与耐旱性研究进展

1.1.1植物对非生物胁迫的应答机制

1.1.2植物的抗旱机制

1.1.3作物抗旱性鉴定方法与指标

1.2甜菜碱及其合成酶基因工程研究进展

1.2.1甜菜碱

1.2.2甜菜碱的生物合成

1.2.3 甜菜碱合成基因工程研究进展

1.3本研究的目的和意义

2盐角草SeCMO和SePEAMT基因在大肠杆菌中的表达

2.1材料与试剂

2.1.1实验材料

2.1.2试剂

2.2实验方法

2.2.1 SeCMO和SePEAMT原核表达载体构建

2.2.2表达菌株的获得

2.2.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及SDS-PAGE分析

2.2.4融合蛋白表达形式鉴定

2.2.5表达产物的纯化

2.3结果与分析

2.3.1原核表达载体pGEX6p1-SeCMO和pGEX6p1-SePEAMT构建

2.3.2表达菌株的获得

2.3.3诱导表达

2.3.4融合蛋白表达形式鉴定

2.3.5融合蛋白纯化

2.4 讨论

2.5 小结

3转基因烟草耐旱性研究

3.1实验材料

3.1.1植物材料

3.1.2试剂

3.1.3实验仪器

3.1.4实验用营养液及培养基的配制

3.2实验方法

3.2.1实验材料的培养及处理

3.2.2甜菜碱含量测定

3.2.3相对含水量的测定

3.2.4 叶绿素含量的测定

3.2.5 光合作用的测定

3.2.6质膜损伤程度测定

3.2.7抗氧化酶活性的测定

3.2.8其它渗透调节物质

3.3结果与分析

3.3.1 干旱胁迫对甜菜碱含量的影响

3.3.2干旱胁迫对相对含水量的影响

3.3.3干旱胁迫对光合作用的影响

3.3.4干旱胁迫对叶绿素含量的影响

3.3.5干旱胁迫对植物细胞的损伤

3.3.6干旱胁迫下细胞内抗氧化酶(SOD、POD)的变化

3.3.7干旱胁迫下细胞内其它渗透调节物质的变化

3.4 讨论

3.5 小结

结 论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢