多环芳烃降解菌的筛选、降解机理及降解性能研究

摘要

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一类典型的持久性有机污染物，具有高毒性、高生物富集性和难以降解等特点。PAHs污染环境的修复一直是环境科学技术领域的研究热点，其中微生物修复因具有成本低、无二次污染等优势而具有较大的应用潜力。自然界中存在着丰富的降解菌源，但在PAHs污染点，由于污染物分布不均及传质效率低等局限，进化成高效PAHs降解菌需要漫长的过程。本论文以高浓度的菲和芘为外界环境压力，从化工厂处理污水的活性污泥中筛选高效降解菌，监测菲或芘选择压力下菌群组成及对PAHs降解能力的动态变化，从中获得了两个能以菲或芘为唯一生长底物的高效PAHs降解菌群。从中分别挑选出两株高效降解菌株，对其降解机制进行了系统研究。论文的主要研究内容和结果如下:
　　1.分别采用4g/L的菲和芘为唯一碳源，经过10次传代驯化培养，从活性污泥中获得了组成和降解性能相对稳定的两个高效PAHs降解菌群，分别被命名为菲菌和芘菌。在传代驯化过程中，采用PCR-DGGE监测菌群组成的动态变化，结果显示最初的污泥样品中含有丰富的菌群，但在高浓度菲或芘的持续环境压力下，随着驯化代数的增加，菌群的数量逐渐减少，组成变得相对稳定。菲菌和芘菌驯化的难度和菌群的组成及PAHs降解能力均有很大差别。第一代菲菌的驯化仅用了5-7天，而第一代芘菌的驯化用了近1个月的时间;在菌群的组成上，菲菌主要由Acidovorax sp.、Pandoraea sp.、Pseudomonassp.和Enterobacter sp.等组成。而芘菌主要由Achromobacter sp.、Empedobacter sp.和Pseudomonas sp.等组成。在PAHs的降解能力上，芘菌对高环PAHs的降解能力优于菲菌，对等浓度的16种PAHs，7天内，芘菌能够降解其中的11种，其中对萘、二氢苊、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘8种PAHs的降解率为100％，对苯并(a)蒽的降解率为36％，屈的降解率为29％，苯并芘的降解率为13％;而菲菌在相同降解条件下，对其中的10种有降解能力，对萘、二氢苊、苊、芴、菲5种PAHs的降解率为100％，蒽的降解率为87％，荧蒽的降解率88％，芘的降解率66％，苯并(a)蒽的降解率为22％，屈的降解率为11％，基本不降解苯并芘。此外，两个混菌在人工污染土壤中均显示出对PAHs较好的降解能力。
　　2.为了研究菲菌和芘菌的降解机制，分别从中筛选出以菲为唯一碳源的高效降解菌株Pseudomonas sp.JM2和以芘为唯一碳源的高效降解菌Pseudomonas sp.Jpyr-1。研究发现，JM2菲降解基因簇位于质粒DNA上，通过设计一系列简并引物进行基因扩增、测序，解析了该菌菲双加氧酶至2-羧基苯甲醛脱氢酶的全套降解酶基因序列，将其与14种已知的PAHs降解菌降解基因进行序列比对，发现与Alcaligenes faecalis AFK2有96％的同源性。结合检测到的邻苯二甲酸代谢产物分析，推测该菌株与产碱杆菌AFK2类似，通过邻苯二甲酸途径降解菲。在Jpyr-1降解芘的过程中检测到四种中间代谢产物菲-4-羧酸、1-羟基-2-萘甲酸、邻苯二甲酸和3，4-二氢二醇邻苯二甲酸，参考其它芘降解菌的代谢途径，推测Jpyr-1经由邻苯二甲酸途径降解芘。以Jpyr-1质粒为模板，通过设计简并引物，扩增出芘双加氧酶的仅和β亚基基因序列。序列比对显示，该双加氧酶α亚基基因序列与革兰氏阳性菌分支杆菌Mycobacterium sp.6PY1的相应基因有90％的相似性。
　　3.设计了一系列两种PAHs共存体系，研究不同结构PAHs对菲降解菌JM2和芘降解菌Jpyr-1降解能力的影响。研究发现:芴、蒽或者荧蒽的存在对JM2降解其它PAHs均起到不同程度的抑制作用，而菲则起到促进作用。两种PAHs共存体系对Jpyr-1降解能力的影响在降解初期24h内，与JM2的规律相似，即芴、蒽和荧蒽对芘的降解起到了抑制作用，而菲的存在明显的促进芘的降解。但在144h后，除了芴的存在一直抑制芘的降解外，荧蒽对芘降解的抑制作用明显降低，而蒽对降解则有所促进。
　　通过上述一系列研究，采用高浓度的PAHs作为环境选择压力，获得了高效PAHs降解菌群，特别是对高环PAHs具有较强降解能力的芘降解混菌;以降解菌群中的高效降解单菌为例，研究了其对菲和芘的代谢途径，对其降解机制进行了解析;在此基础上，进一步考察了PAHs组成对其降解的影响规律。上述一系列研究结果将对PAHs降解菌在环境修复中的应用提供重要依据。

目录

声明

摘要

绪论

1 多环芳烃及其生物降解研究进展

1．1 多环芳烃的性质及污染现状

1．1．1 多环芳烃的性质

1．1．2 多环芳烃的来源

1．1．3 多环芳烃的污染状况

1．1．4 多环芳烃的毒性特征

1．2 微生物降解多环芳烃的研究进展

1．2．1 微生物修复

1．2．2 PAHs降解菌的筛选及其降解能力研究

1．2．3 微生物对多环芳烃的代谢机制研究

1．3 本文的主要研究内容与思路

2 菲和芘胁迫对环境菌群种类及降解能力的影响

2．1 引言

2．2 实验材料及方法

2．2．1 试剂与仪器

2．2．2 培养基组成

2．2．3 PAHs降解菌群的筛选及鉴定方法

2．2．4 菌群降解能力的测定方法

2．3 实验结果及讨论

2．3．1 菲和芘不同选择压力对菌群生长的影响

2．3．2 菲和芘不同选择压力对菌群结构的影响

2．3．3 不同代数菲菌和芘菌的PAHs降解能力研究

2．3．4 菲、芘混菌对4PAHs和16PAHs混合物降解能力的研究

2．3．5 菲菌和芘菌对含4 PAHs污染土壤降解能力的研究

2．4 小结

3 Pseudomonas sp．JM2的PAHs降解特性和机制研究

3．1 引言

3．2 实验材料及方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 液相降解体系的制备

3．2．3 代谢物分析降解体系制备和处理

3．2．4 样品的定性定量检测

3．2．5 phn途径相关基因的分离

3．2．6 JM2的菲降解途径基因簇的克隆

3．3 实验结果及讨论

3．3．1 JM2对PAHs混合物降解能力的研究

3．3．2 不同初始浓度菲对JM2生物降解的影响

3．3．3 添加物对JM2降解菲能力影响的研究

3．3．4 温度和pH对单菌JM2降解PAHs能力影响的研究

3．3．5 接种量对JM2降解PAHs能力影响的研究

3．3．6 PAHs降解产物定性分析

3．3．7 JM2降解基因在胞内所处位置分析

3．3．8 JM2降解基因phrAc的部分片段解析

3．3．9 JM2菲降解基因簇的解析(phnAb-phnE)

3．3．10 JM2的phnAc的关键氨基酸组成分析

3．4 小结

4 Pseudomonas sp．Jpyr-1的PAHs降解能力和机制研究

4．1 引言

4．2 实验材料和方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 液相降解体系的制备

4．2．3 用于代谢物分析的降解体系

4．2．4 芘双加氧酶相关基因分析

4．2．5 Jpyr-1中芘双加氧酶的剩余基因片段解析

4．2．6 双加氧酶与PAHs相互作用分析

4．3 结果和讨论

4．3．1 Jpyr-1对PAHs混合物降解能力的研究

4．3．2 芘的初始浓度对Jpyr-1生物降解的影响

4．3．3 Jpyr-1降解产物定性分析

4．3．4 Jpyr-1芘双加氧酶α亚基基因片段的分离

4．3．5 Jpyr-1芘末端双加氧酶全基因的解析

4．3．6 Jpyr-1芘双加氧酶的α亚基序列的分析与比较

4．3．7 末端双加氧酶α亚基与PAHs相互作用的分子模拟

4．4 小结

5 单一底物和双底物体系中降解菌对PAHs降解性能的研究

5．1 引言

5．2 实验材料和方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 单菌JM2，Jpyr-1降解PAHs的相互作用体系的制备

5．2．3 单一底物和双底物体系中，考察单菌JM2，Jpyr-1生长体系的制备

5．2．4 样品分析

5．3 结果和讨论

5．3．1 单一底物和双底物体系中菌株JM2的生长情况

5．3．2 单一底物和双底物体系中菌株JM2对PAHs的降解及其相互作用

5．3．3 单一底物和双底物体系中菌株Jpyr-1的生长情况

5．3．4 其他PAHs的存在对菌株Jpyr-1降解PYR的影响及其相互作用

5．4 小结

结论与展望

参考文献

附录A Pseudomonas sp．JM2的phn基因簇16SrDNA序列

附录B Pseudomonas sp．Jpyr-1的pyd，16SrDNA序列

攻读博士学位期间科研项目及科研成果

致谢

作者简介