黄海北部沉积物厌氧氨氧化细菌多样性及富集研究

摘要

Anammox(anaerobic ammonia oxidation)菌在各类生态环境中具有广泛的分布，尤其对海洋环境中Anammox菌的多样性研究发现，海洋中N2的产生有30％～50％来自于Anammox反应。Anammox菌能够在缺氧或者厌氧的条件下利用NH4+-N作为电子供体，NO2--N作为电子受体直接产生N2，可以降低海洋环境中的氨氮含量，维持海洋生态系统中N循环的正常运转。
　　为了深入研究黄海北部海底沉积物中Anamrnox菌群落多样性分布，本课题利用分子生物学技术，对黄海北部Anammox菌的多样性分布、系统发育和丰度等进行研究，并探究Anammox菌分布和环境因素之间的关系。利用海底沉积物，进行耐盐的海洋性Anammox菌富集。并通过加入MnO2来促进海洋性Anammox菌的富集，使其能够应用到含盐废水处理中。
　　课题选择黄海北部3个位点（J、D和C）共7个采用点(J1、J2、D1、D2、C1、C2和C3)，通过Anammox菌16S rRNA基因克隆文库的建立，共得到69条序列，经National Center of Biotechnology Information(NCBI)比对得出56条序列和Anammox菌Candidatus Scalindua属基因序列有较高的相似性(≥98％)，这一结果占总测序列的81.7％。在每个采样点均得到海洋性Anammox菌基因序列，说明海洋性Anammox菌广泛分布于黄海北部地区。D1采样点的Anammox菌16S rRNA基因的拷贝数最高为4.31×106 copies·(g sediments)-1，C1采样点最低为1.07×106 copies·(g sediments)-1。通过史皮尔曼等级相关系数分析(p)可知，黄海北部沉积物孔隙水中DIN（溶解态无机氮）、NH4+-N和NO2-N浓度对Anammox菌数量影响较大。通过冗余(RDA)分析可知，J、C和D位点Anammox菌群落分布的主要影响因素并不相同。本研究展示了黄海北部Anammox菌群落分布特性，说明其在海洋环境中具有广泛分布。Anammox菌的群落分布受到多因素的影响，不同环境条件下对其群落分布影响的环境因素也不尽相同。
　　根据多样性的分析结果，采用D1采样点沉积物作为反应器接种底泥。采用上流式固定床反应器R1（加入MnO2）和R2常温运行，结果表明，在反应器运行近150 d中，加入MnO2的R1反应器的最大总氮去除率为137.82 g-N/(m3·d)，比没有加入MnO2的R2反应器高出近20 g-N/(m3·d)。在低温环境(10～15℃)运行时，R1反应器的氨态氮和亚硝态氮去除率比R2反应器均高出10％，且R1反应器对温度变化的适应性和运行稳定性都好于R2反应器。这表明，MnO2的加入在一定程度上促进了海洋性Anammox细菌的富集并增强了对温度变化的适应性，为含盐废水处理提供了又一参考方法。

目录

声明

摘要

引言

1 综述

1．1 海洋氮循环概述

1．1．1 氮的存在形态

1．1．2 海洋氮循环

1．2 厌氧氨氧化细菌概述

1．2．1 厌氧氨氧化细菌的生化反应机理

1．2．2 厌氧氨氧化细菌的多样性研究

1．2．3 厌氧氨氧化细菌对海洋氮循环的作用

1．3 厌氧氨氧化细菌富集培养研究概述

1．3．1 富集厌氧氨氧化细菌的反应器

1．3．2 影响厌氧氨氧化细菌富集的因素

1．3．2 Mn元素对厌氧氨氧化细菌的影响

1．4 厌氧氨氧化细菌多样性的研究方法

1．4．1 克隆基因文库法

1．4．2 DGGE

1．4．3 RT-PCR

2 研究目的、内容和技术路线

2．1 研究目的

2．2 研究内容

2．3 研究的技术路线

3 实验材料和方法

3．1 实验材料

3．1．1 样品采集

3．1．2 沉积物样品理化指标的测定

3．1．3 实验主要试剂

3．1．4 实验主要分子生物学试剂盒

3．1．5 实验主要培养基

3．1．6 实验主要引物

3．1．7 富集海洋性Anammox菌的实验装置和工艺流程

3．1．8 实验主要显色剂配制方法

3．1．9 实验主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 Anammox菌16S rRNA基因文库的构建

3．2．2 沉积物中Anammox菌和总菌16S rRNA基因定量分析

3．2．3 Anammox菌16S rRNA基因序列分析方法及统计学分析方法

3．2．4 富集海洋性Anammox菌反应器化学指标分析方法

4 黄海北部海底沉积物Anammox菌数量和群落多样性研究

4．1 沉积物理化指标性质初步研究

4．2 黄海北部海底沉积物Anammox菌群落多样性分析

4．2．1 沉积物宏基因组DNA提取结果与分析

4．2．2 Anammox菌16S rRNA基因PCR扩增结果与分析

4．2．3 Anammox菌系统发育树的建立与分析

4．3 沉积物Anammox菌和总菌16S rRNA基因定量分析

4．3．1 Anammox菌和总菌16S rRNA基因RT-PCR标准曲线结果分析

4．3．2 海底沉积物中Anammox菌和总菌16S rRNA基因定量结果分析

4．4 沉积物中Anammox细菌与其环境因素之间的关系

4．4．1 史皮尔曼等级相关系数分析(ρ)

4．4．2 冗余(Redundancy analysis，RDA)分析

4．5 本章小结

5 MnO2对海底沉积物Anammox菌的富集培养影响研究

5．1 反应器接种底泥的选择

5．2 R1反应器和R2反应器的启动情况

5．2．1 反应器运行适应阶段

5．2．2 反应器运行活性提高阶段

5．2．3 反应器运行活性恢复阶段及稳定阶段

5．3 R1反应器和R2反应器运行过程中总氮变化情况

5．4 本章小结

结论

参考文献

附录A

附录B

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢