毕赤酵母生产重组蛋白A工艺研究

摘要

金黄色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal Protein A，SPA）是金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，具有与免疫球蛋白特异性结合的能力。SPA被广泛的应用于抗体分离纯化、免疫检测和诊断等方面，市场需求量巨大。目前所应用的SPA多是以大肠杆菌为表达系统生产的重组蛋白A(rSPA)。此种生产技术中rSPA为大肠杆菌的胞内蛋白，发酵密度不高，后续纯化分离工艺步骤繁琐复杂，产品得率低，生产成本高。为此，本论文尝试以含SPA基因的重组毕赤酵母rGS115-spa为表达系统，对其分泌表达的高密度发酵和后续纯化工艺进行深入研究，尝试建立了一套新的rSPA大规模生产工艺。
　　首先，本论文通过摇瓶实验探索rGS115-spa在摇瓶中的蛋白表达情况，通过对诱导温度、pH、诱导剂浓度、诱导时间等条件的优化，确定相对较优的表达条件，为后续高密度发酵实验奠定基础。
　　其次，在前期摇瓶实验基础上，对5L发酵罐中rSPA的表达条件进行优化，包括诱导起始时菌体密度、诱导温度、pH和诱导时间等，最终确定在菌体密度达到OD600为300-350时开始诱导，温度22℃，诱导pH为3.0，经68 h的诱导后，rSPA产量可达8.8g/L，占发酵液中总蛋白的80％以上，较大肠杆菌表达系统有明显提高。
　　然后，利用发酵所得含rSPA发酵上清液，进行其分离纯化工艺的研究。利用毕赤酵母生产的rSPA是分泌型蛋白，可以省去细胞破碎、DNA沉淀等前处理步骤，但发酵液中色素及降解片段的去除是rSPA分离纯化工艺的难点。由于色素类物质可吸附到大部分层析介质上，影响层析柱使用效果，本论文尝试利用硫酸铵沉淀或乙醇沉淀偶联活性炭吸附和除盐柱过滤等手段去除色素。综合色素去除效果、蛋白回收率以及操作简便性等因素考虑，最终选用除盐柱进行色素去除。去除大部分色素后的rSPA溶液被置换为25 mM，pH8.0的Tis-HCl缓冲液，经过DEAE离子交换层析纯化后去除了原发酵液中降解产物，洗脱液rSPA纯度可达色谱纯标准，回收率高达79.4％。
　　最后，本论文利用Western Blot和IgG亲和柱对纯化后的rSPA进行了鉴定，证明rSPA具有良好的免疫活性。并利用HPLC和MALDI-TOF-MS对纯化后的rSPA的纯度和分子量进行了鉴定，结果表明其纯度接近100％，分子量与理论值基本吻合。
　　本论文的研究工作，尝试建立了一种全新的rSPA发酵生产和纯化工艺。较原有生产工艺相比，提高了rSPA产量，简化了纯化步骤，并降低了生产成本，为今后rSPA的生产提供了另一可选方案。

目录

声明

摘要

引言

1 文献摘要

1．1 金黄色葡萄球菌蛋白A

1．1．1 金黄色葡萄球菌蛋白A的发现

1．1．2 SPA结构与功能

1．1．3 SPA的应用价值

1．1．4 SPA的大规模生产与纯化

1．2 巴斯德毕赤酵母表达系统

1．2．1 巴斯德毕赤酵母表达系统

1．2．2 巴斯德毕赤酵母表达系统菌株

1．2．3 巴斯德毕赤酵母表达系统载体

1．2．4 巴斯德毕赤酵母中外源基因的重组方式

1．2．5 巴斯德毕赤酵母表达系统大规模发酵培养条件

1．3 蛋白质纯化技术

1．3．1 蛋白纯化策略

1．3．2 决定纯化过程蛋白性质

1．3．3 蛋白纯化关键技术

1．3．4 重组蛋白分析与鉴定

1．4 论文的研究内容、目标及意义

2 摇瓶中毕赤酵母表达rSPA条件优化

2．1 引言

2．2 实验试剂及器材

2．2．1 主要试剂与材料

2．2．2 主要实验仪器

2．2．3 主要溶液及配制方法

2．3 实验方法

2．3．1 重组毕赤酵母rGS115菌种活化

2．3．2 rSPA摇瓶诱导表达条件的优化

2．3．3 SDS-PAGE

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 诱导温度对rSPA表达的影响

2．4．2 诱导pH对rSPA表达的影响

2．4．3 诱导剂浓度对rSPA表达的影响

2．4．4 诱导时间对rSPA表达的影响

2．5 小结

3 发酵罐中毕赤酵母表达rSPA条件优化

3．1 引言

3．2 实验试剂及器材

3．2．1 主要试剂与材料

3．2．2 主要实验仪器

3．2．3 主要溶液及配制方法

3．3 实验方法

3．3．1 BCA法测定总蛋白浓度

3．3．2 靛酚蓝比色法测定NH4+离子浓度

3．3．3 外标法测定发酵液中甲醇浓度

3．3．4 发酵种子活化

3．3．5 rSPA发酵条件优化

3．3．6 菌体死亡率测定

3．3．7 蛋白样品IgG亲和活性检测

3．3．8 蛋白样品Western Blot分析

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 诱导起始菌体密度对rSPA发酵的影响

3．4．2 诱导温度对rSPA发酵的影响

3．4．3 诱导pH对rSPA发酵的影响

3．4．4 诱导时间对rSPA表达的影响

3．4．5 甲醇和NH4+浓度的检测

3．4．6 蛋白样品IgG亲和活性检测

3．4．7 蛋白样品Western Blot分析结果

3．5 小结

4 rSPA分离纯化工艺研究

4．1 引言

4．2 实验试剂及器材

4．2．1 主要试剂与材料

4．2．2 主要实验仪器

4．2．3 主要溶液及配制方法

4．3 实验方法

4．3．1 发酵液中色素的去除

4．3．2 DEAE离子交换层析

4．3．3 纯化后样品Western blot检测

4．3．4 高效液相色谱法检测纯化后样品纯度

4．3．5 纯化后样品分子量测定

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 发酵液中色素的去除

4．4．2 DEAE离子交换层析

4．4．3 纯化后样品Western Blot检测

4．4．4 高效液相色谱法检测纯化后样品纯度

4．4．5 纯化后样品分子量测定

4．4 小结

结论与展望

参考文献

附录A 基因重组蛋白A氨基酸序列

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢