脂肪酶催化制备中碳链结构脂和阿魏酰结构磷脂

摘要

中碳链结构脂具有供能及时，改善人体对长碳链脂肪酸的吸收，满足人体对必需脂肪酸的需求，弥补长碳链甘三酯和中碳链甘三酯的缺陷等优点，其为制备肠道药品和肠胃营养品脂肪乳的重要原材料。中碳链结构脂特殊的脂肪酸定位分布，传统的化学催化剂难以胜任其制备工作，脂肪酶以其具有位置选择性、反应条件温和等优点成为制备中碳链结构脂的重要生物催化剂。但目前报道的酶法制备中碳链结构脂方法中存在脂肪酶价格高，底物侵蚀脂肪酶致其失活和批式反应中原料及能耗大等缺陷。本文主要针对以上存在的问题进行了如下研究。
　　阿魏酸(Ferulicacid，FA)是一种天然的抗氧化剂，具有清除自由基、保护细胞、抑制血栓素释放、抗癌、抗菌消炎等功能，广泛应用于食品、医药及化妆品等领域。但由于FA在油相和水相体系中的溶解度都较低，很难渗透进入生物脂质层发挥作用，因此FA衍生物的制备成为热点问题。磷脂是细胞膜的基本组成成分，对维持细胞的通透性和细胞内氧的传递起着重要作用。若将FA分子结合到磷脂分子上，可以有效解决其生物利用度低的问题，同时可以保证FA的生理活性不受影响。由于FA和磷脂均为热敏性物质，本文利用脂肪酶催化制备阿魏酰结构磷脂(FLPs)，同时对其合成路线、反应介质的选择、结构表征及反应条件的优化进行了研究。
　　在无溶剂体系下，选择以中碳链脂肪酸（辛酸、癸酸）为酰基供体、以LipozymeRMIM为最佳生物催化剂制备中碳链结构脂。基于目标产物的特定要求（如配方FE73403），考察了不同反应条件，包括脂肪酸摩尔比、底物摩尔比、反应温度、加酶量、酶的重复利用次数，对脂肪酸插入率的影响。在反应条件为辛酸、癸酸摩尔比4∶1，底物（酸/大豆油）摩尔比6∶1，温度55℃，加酶量7wt％（以总底物质量计），反应4h可达到目标配方FE73403的要求，并且酶可以重复利用12次以上。用分子蒸馏法对产品进行了分离纯化，分馏产品的甘三酯含量达90％以上，羟值为9.71，脂肪酸组成及sn-2脂肪酸组成符合目标配方FE73403要求。另外，对该反应的反应动力学及反应机制进行了研究。反应的活化能为21.1kJ/mol，酶促反应动力学参数Km和Vm分别为2.28mol/L和18.52mol/(L×min)。
　　为了降低底物对固定化脂肪酶载体的侵蚀，增加脂肪酶的催化活性，建立了新的反应体系，以实验室自制中碳链脂肪酸乙酯（纯度达90％以上）为酰基供体、以价格便宜的脂肪酶LipozymeTLIM为生物催化剂制备中碳链结构脂。基于目标配方FE73403，考察了不同反应条件，包括脂肪酸乙酯摩尔比、底物摩尔比、反应温度、加酶量，对脂肪酸插入率的影响。在反应条件为辛酸乙酯、癸酸乙酯摩尔比3∶1，底物（乙酯/大豆油）摩尔比6∶1，反应温度60℃，加酶量13wt％（以总底物质量计），反应可较快达到目标配方FE73403的要求。同时考察了脂肪酶的重复利用次数，当反应进行12批次(每批次12h)时，脂肪酶的活力降低明显，该酶稳定性有待进一步提高。该反应的活化能为30.1kJ/mol，酶促反应动力学参数Km和Vm分别为4.02mol/L和4.94mol/(L×min)。
　　为了有效解决批式反应中原料、能耗大及生产能力低等问题，本文利用中碳链甘三酯(MCT)为酰基供体，设计并组装了固定床连续反应装置，优化了连续法制备中碳链结构脂的工艺参数，对脂肪酶的稳定性进行了考察，并用不同极性的溶剂（丙酮、异丙醇、叔丁醇和异丁醇）处理使用过的脂肪酶，对酶的循环使用进行了研究。通过批式反应中比较了两种酶的催化性能，尽管LipozymeRMIM的sn-1，3位专一性较好，但LipozymeTLIM具有明显的价格优势，后续研究采用价格低廉的脂肪酶LipozymeTLIM。连续反应最佳保留时间及反应温度为30-40min和55℃，在此条件下，连续反应204h后，LipozymeTLIM酶活损失较大，经丙酮处理后，该酶至少可循环使用四批次，可使反应的转酯化度从40％提高至55％左右。
　　本文初步建立了以磷脂酰胆碱(PC)与阿魏酸乙酯(EF)为底物脂肪酶催化制备FLPs的反应体系以及定性定量分析产物的方法，开发了一条两步酶法制备FLPs的反应路线:第一步在脂肪酶催化下水解底物PC制得溶血磷脂酰胆碱(LPC)和甘油磷脂酰胆碱(GPC)，第二步将EF加入上述反应体系中，在脂肪酶催化下制备FLPs。对不同来源的脂肪酶及反应体系进行了筛选，最佳生物催化剂和反应介质分别为Novozym435和甲苯。利用制备型高效液相色谱制备了高纯产物—1-阿魏酰-溶血磷脂酰胆碱(1-FLP)，通过TLC、HPLC、LC-MS和核磁共振对产物进行了结构鉴定，确定了合成产物的分子结构为1-FLP。
　　对利用PC和EF为底物制备FLPs的反应条件进行了单因素优化，最佳反应条件为:甲苯/三氯甲烷(90∶10，v/v)5mL，PC最佳水解时间1.5h，底物摩尔比(PC∶EF)5∶1，最佳脂肪酶Novozym435用量60mg/mL，反应温度55℃，4(A)分子筛100mg/mL。在最佳反应条件下反应4天，FLPs转化率可提高至40.15±1.25％。通过响应面曲线法对反应条件进行了综合优化，最佳反应条件是:底物摩尔比5∶1，PC水解时间1.5h，酶量63mg/mL，分子筛的量100mg/mL，反应温度61℃，最大理论转化率为53.21±1.78％。在最佳条件下，进行4批次试验，FLPs转化率平均值为50.18±0.92％。