β2-微球蛋白抗体吸附剂的合成及性能评价

摘要

β2M是主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ类分子的轻链，参与细胞间相互识别及免疫应答的诱导。然而，在肾衰患者体内β2M不能被正常代谢，积累在血液中成为毒素，并产生各类并发症。目前针对高β2M血症并发症的治疗方法有药物治疗和外科手术，这两种方法只能缓解疼痛和修复损伤，且有很大副作用。血液净化方式能从根源上降低肾衰患者血液中的β2M水平，因此被认为是治疗β2M血症最有效的方式之一。而现有的血液净化材料对β2M吸附选择性过低，在治疗的同时丢失了很多对人体有益的其它分子。本论文利用亲和能力强、稳定性好的特异性卵黄抗体IgY为配基制备亲和吸附剂，并进行性能评价;同时，也表达了抗β2M的二价纳米抗体并对其进行亲和纯化和活性验证，证明了将其应用于血液净化治疗β2M血症的可行性。本论文研究内容分为以下三部分:
　　(1) IgY的获得与纯化。利用已获得的β2M溶液为抗原免疫蛋鸡，提取卵黄上清液并进行粗分离，利用两种不同路径合成的Sepharose-β2M吸附剂对IgY进行亲和纯化，第二种吸附剂纯化效果明显优于第一种，纯化后IgY效价可提高80倍。
　　(2) IgY吸附剂的合成及性能评价。利用纯化后的IgY为配基，通过两种不同路径合成吸附剂Ⅰ和Ⅱ，分别测定其对β2M结合能力:亲和常数分别为7.06×106L/mol和1.84×106L/mol，均具有良好的亲和能力;两种吸附剂重复使用5次后其对β2M吸附能力仍然稳定，饱和吸附量分别维持在50μg/mL和35μg/mL以上;将两种吸附剂分别用0.01M NaOH溶液和1mM稀HCl溶液浸泡12h后，用间接ELISA法测定上清液的A450值与空白对照基本相等，配基无脱落且其饱和吸附量不变;此外，两种吸附剂对血清中其他非特异性组分不产生明显吸附。
　　(3)二价纳米抗体的原核表达及活性验证。将重组质粒pET23a-β2M转化感受态细胞BL21(DE3)，经活化、诱导后得到表达。目的蛋白分子量约为30kDa，表达形式为包涵体，占总蛋白表达量的32％。包涵体进行稀释复性的效率最高，为25％。对稀释复性后的可溶蛋白溶液进行活性验证可知，复性后的部分VHH2具有活性，这些有活性的VHH2可应用于合成血液净化吸附剂或者检测β2M血症的试剂。