三个柞蚕脂肪酶基因的克隆及表达分析

摘要

柞蚕，属于鳞翅目昆虫，主要分布于东北、山东和广西等地，是一种重要的经济昆虫。柞蚕脓病是一种由柞蚕核型多角体病毒引起的病虫害，曾经造成柞蚕的大量减产。目前对于昆虫对病原微生物尤其是对细菌的免疫反应已经取得了显著的研究进展，但关于其抗病毒免疫的研究还较少。因此，开展柞蚕抗病毒免疫的研究有着重要的理论和现实意义。
　　家蚕脂肪酶是一种在家蚕消化液中分离出的具有抗家蚕核型多角体病毒的蛋白，也是目前明确鉴定的为数不多的一种抗病毒蛋白。依据此线索我们以柞蚕脂肪体cDNA为模板，克隆了3个柞蚕脂肪酶基因并对其进行了生物信息学分析。3个基因开放阅读框长度分别为1000bp、1000bp和876bp，并将其分别命名为lipase1462（GeneBank登录号:KJ638233），lipase1502（GeneBank登录号:KJ638234）和lipase1725(GeneBank登录号:KJ638235)。通过在线预测分析发现，3个柞蚕脂肪酶基因均具有脂肪酶家族具有的保守性结构域及活性位点，同属于脂肪酶家族。
　　为研究柞蚕脂肪酶基因在柞蚕免疫中的作用，利用实时定量的方法测定了脂肪酶基因在经不同病原微生物诱导处理的柞蚕蛹不同组织中相对表达量的变化。实验结果表明，经病原微生物处理后，3个脂肪酶基因的表达量均有显著的变化，但不同组织中的表达上调水平具有一定的差异性。为进一步研究柞蚕脂肪酶基因的表达是否与柞蚕对核型多角体病毒(ApNPV)侵染的抗性有关，利用实时定量PCR技术检测3个柞蚕脂肪酶基因在感染ApNPV后的幼虫脂肪体和中肠的表达水平变化。结果表明，柞蚕幼虫被ApNPV感染48～60h后，脂肪体和中肠中3个脂肪酶基因的表达水平均明显上调，初步推测柞蚕脂肪酶可能与柞蚕对ApNPV的免疫反应相关。
　　构建了柞蚕脂肪酶基因的原核及真核表达载体，分别利用大肠杆菌和昆虫杆状病毒表达系统对其进行了原核表达和真核表达。SDS-PAGE电泳检测显示3个柞蚕脂肪酶基因在原核和真核系统中均已成功表达。原核表达系统表达的柞蚕脂肪酶以包涵体的形式存在，表达量高，可用于抗体的制备，为后续的实验研究奠定了基础。真核表达的脂肪酶具有一定的生物学活性，可以应用于今后对柞蚕脂肪酶蛋白抗病毒等方面的生物学功能研究。