蒽醌类BH3模拟物Compound6诱导黑色素瘤细胞凋亡的分子药理学机制研究

摘要

Bcl-2家族蛋白对于细胞凋亡的调控起着关键性作用。小分子Bcl-2类蛋白抑制剂是通过模拟促凋亡蛋白BH3-only蛋白，从而抑制抗凋亡蛋白的功能，为新的抗肿瘤治疗策略提供了一个非常有前景的方向。
　　黑色素瘤中的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是高度激活的，直接或间接导致了黑色素瘤对目前几乎所有的治疗手段的抗性和不良预后。Bcl-2类蛋白抑制剂在黑色素瘤的分子药理研究中同样发现了抗性问题，可能也和MAPK信号通路的激活有关。因此，研究Bcl-2类蛋白抑制剂诱导黑色素瘤细胞凋亡的分子机制不仅有助于更深入的了解黑色素瘤的药物抗性的分子机制，同时也为未来发展黑色素瘤的治疗策略和临床研究提供了理论依据。
　　本文对比研究BH3模拟物S1、gossypol和ABT-737在黑色素瘤细胞中的细胞毒性，及这些BH3模拟物对Bcl-2家族蛋白之间相互作用的影响，揭示了高水平磷酸化的抗凋亡蛋白Mcl-1(pMcl-1)是黑色素瘤对目前已知BH3模拟物抗性的关键原因。本课题组设计合成了一系列蒽醌类BH3模拟物小分子Bcl-2类蛋白抑制剂。与目前其他的BH3模拟物不同的是，它们实现了对重要BH3-only蛋白Bim螺旋的双面模拟，达到从结构和功能两个方面模拟Bim蛋白α-螺旋，以高亲和力结合Bcl-2家族中抗凋亡蛋白，并诱导Bax/Bak依赖的内源细胞凋亡。本文筛选得到蒽醌类BH3模拟物Compound6。与上述其他BH3模拟物不同的是，Compound6能够克服黑色素瘤抗性，显著地诱导黑色素瘤细胞凋亡。
　　通过免疫共沉淀实验检测了Compound6对黑色素瘤细胞内Bcl-2家族蛋白之间相互作用的影响，并用免疫印迹法检测了后续Bax/Bak的激活、细胞色素C释放、PARP的剪切和caspase-3/9的激活。这些结果表明Compound6是通过解离细胞中pMcl-1/Bim和pMcl-1/Bak异源二聚体，诱导Bax/Bak依赖的内源性细胞凋亡来杀伤黑色素瘤细胞的。
　　本文还利用免疫印迹法分析了ERK抑制剂PD98059和JNK抑制剂SP610025对黑色素瘤中Mcl-1磷酸化水平的影响，结果表明ERK与JNK都参与了黑色素瘤中Mcl-1蛋白的磷酸化。接下来，通过MTT法检测了PD98059和SP610025联合S1作用在黑色素瘤中的细胞毒性，结果表明PD98059和SP610025都能显著地增强黑色素瘤对S1的敏感性，这进一步的证实了是ERK与JNK诱导的Mcl-1磷酸化导致了黑色素瘤对BH3模拟物的抗性。
　　免疫印迹实验结果显示在Compound6的作用下黑色素瘤中的pMcl-1会发生降解。接下来，本文利用蛋白酶体抑制剂MG-132和广谱caspase抑制剂zVADfmk分别与Compound6联合作用黑色素瘤细胞，结果表明Compound6能够引起的pMcl-1降解是capase依赖的。
　　在本文的研究中还发现A375细胞在Compound6的作用下会发生Noxa表达水平的上调，经过进一步使用定量PCR的方法发现Noxa的上调是发生在转录水平。最后，利用Noxa的shNoxa下调黑色素瘤中的Noxa蛋白水平，并通过MTT法、免疫印迹法和免疫共沉淀实验检测了Compound6在其中的毒性，以及对pMcl-/Bim，pMcl-1/Bak复合物的影响，结果表明Compound6诱导黑色素瘤细胞凋亡并不依赖于Noxa水平的上调。
　　本研究首次证实了pMcl-1能够拮抗的BH3模拟物小分子Bcl-2抑制剂，确定了ERK与JNK都参与了Mcl-1磷酸化并增强其抗凋亡功能，并确定pMcl-1是黑色素瘤新的治疗靶点。此外，本文还筛选得到了首个pMcl-1直接抑制剂Compound6。这些研究结果有助于我们进一步的了解pMcl-1的抗凋亡功能，为未来研究黑色素瘤新的治疗策略提供了理论依据。