转瓶中组织工程骨软骨复合物的动态构建

摘要

由关节退行性疾病和创伤等原因引起的骨软骨损伤病例日益增多，软骨组织本身修复水平有限，临床现有的修复软骨损伤及创伤的方法，并不能完全恢复软骨组织的功能。组织工程骨软骨的迅速发展为修复临床软骨大面积的损伤带来了新希望，其核心除了构建细胞-支架的复合体外，体外培养环境也极为重要，传统的体外培养的方式为静态培养，但是这种方式在组织超过一定厚度时，氧气和营养物质等扩散会受到限制，阻碍营养物质的提供及代谢废物的排出，这样会影响支架内细胞的增殖及分化，基于此利用生物反应器的动态培养受到了越来越多研究者的青睐。本研究采用经脱脂、脱细胞等处理后的松质骨支架作为骨仿生支架，利用壳聚糖与阴离子聚合体交联的特性，和明胶混合，通过冷冻干燥致孔法，制备壳聚糖/明胶多孔复合支架作为软骨支架材料，接种人脂肪干细胞(Human Adipose-derived stem cells，hADSCs)后，分别于成骨诱导基及软骨诱导基培养，构建组织工程骨及组织工程软骨，待培养两周后，采用缝合的方式将两部分结合，置于转瓶动态培养，以尽快完成体外骨软骨的动态构建。
　　脱细胞松质骨及壳聚糖/明胶水凝胶支架的制备及其物理性质:将猪骨清洗后，经甲醇/氯仿脱脂，脱氧胆酸钠脱细胞处理及H2O2脱蛋白后，制得脱细胞松质骨支架。将2％壳聚糖醋酸溶液与明胶溶液以质量比3∶1混合，冷冻干燥后置于碳化二亚胺/羟基琥珀酰胺/吗啉乙烷磺酸(EDC/NHS/MES)交联液中交联6h，加入Na2HPO4溶液中和支架中的醋酸2h，再次冷冻干燥得到交联后的水凝胶支架。然后将支架切成5mm×5mm×5mm小块，扫描电镜(Scanning Electron Microscopy，SEM)下观察骨及软骨支架表面微观形貌，万能实验机测定松质骨及水凝胶的弹性模量，采用比重瓶法检测了水凝胶支架的孔隙率，同时考察了支架的吸水率，红外检测仪分析松质骨的组成成分。结果表明:松质骨支架的平均孔径为284.5士83.62μm，弹性模量为41.27±15.63MPa，红外(Infrared Radiation，IR)检测表明支架仍保留了羟基磷灰石等无机成分及少量蛋白质，与人骨的天然成分相同，具有良好的组织亲和性和结合力。壳聚糖/明胶支架的平均孔径为118.25士19.51μm，孔隙率为82.60±2.34％，吸水率为361.28±0.47％，弹性模量为61.2±0.16KPa。两种支架选材具有良好的生物相容性和物理性能，适于选作骨软骨构建物的支撑材料。
　　人源脂肪干细胞的分离，培养及成骨，成软骨诱导:经胰酶法分离获取脂肪干细胞，然后继续培养，传代。取第5代hADSCs于成骨及软骨诱导基中培养，考察其这两方向的分化潜能。结果表明:细胞呈长梭形贴壁生长，增殖速度快，5天即可传代一次。hADSCs经成骨诱导7天后，碱性磷酸酶阳性表达，诱导28天后，von-Kossa染色，染色结果发现诱导后细胞分泌了大量钙结节。ADSCs经软骨诱导基培养7，14天，经甲苯胺蓝及蕃红花O染色后，可见胞浆及周围粘液有大量异染性基质。以上各种检测结果证明hADSCs可向成骨，软骨细胞分化，适于作为组织工程骨软骨构建的种子细胞。
　　细胞-松质骨复合体的构建及支架中细胞生长及基质分泌情况:将P7-hADSCs以106cells/mL密度接种于松质骨支架内部，每个支架40μL，正反两面，接种细胞后的支架置于37℃，5％ CO2培养箱中培养2h后，在孔板中添加足量成骨诱导基，继续培养，将一半组织构建物移入转瓶中，作为动态实验组Ⅰ组，转瓶的转速为40rpm，剩余复合物及单纯松质骨移入培养瓶中静态培养分别作为对照组Ⅱ组及空白组Ⅲ组，ALP定性及定量试剂盒检测了支架中细胞骨向分化能力，Dead/Live荧光染色定性考察了动静态环境下细胞在松质骨支架中的生长存活情况，葡萄糖检测试剂盒测量了细胞的代谢情况，SEM观察脱细胞松质骨支架中细胞贴附及胞外基质的分泌情况。结果表明:实验组在细胞骨向分化能力要稍高，Dead/Live结果表明动态环境下细胞分布及生长状况更好一些，扫描电镜表明细胞分泌基质更多，转瓶动态培养可以较快完成组织工程骨的构建。
　　细胞-水凝胶复合体的构建及支架中细胞生长及基质分泌情况:与组织工程骨的构建方式一样，将其中20个细胞支架复合物作为静态对照组Ⅱ，另外20个细胞-水凝胶支架转移到制作的不锈钢架的铂丝上，置于转瓶中培养，作为动态实验组Ⅰ。甲苯胺蓝及蕃红花O检测支架中细胞软骨分化能力，Dead/Live荧光染色观察动静态环境下细胞在水凝胶支架中的生长情况，葡萄糖及乳酸试剂盒测量了细胞的代谢情况，SEM观察水凝胶支架上细胞贴附及胞外基质的分泌情况。结果表明:动态环境促进了糖胺多糖的表达及细胞基质的分泌，细胞增殖更明显。
　　骨软骨复合组织的构建及动静态培养:按照构建组织工程骨及软骨的方法，将P7-hADSCs以107cells/mL密度分别接种松质骨及水凝胶支架中，分别添加足量成骨诱导基及软骨诱导基中培养两周后，将两部分用线缝合一起，构建组织工程骨软骨复合物。其中，一半移入转瓶动态培养，另外一半置于培养瓶中静态培养分别作为实验组Ⅰ组和对照组Ⅱ组，一定时间内，进行相关方面检测。激光共聚焦显微镜考察动静态组细胞在各层支架的分布，SEM考察了复合支架界面、软骨及骨部分中细胞及其基质分泌情况。结果表明:两组复合物连接较紧密，Calcein染色表明动态组细胞存活较多且分布更均匀，SEM结果表明两组界面处及工程骨部分细胞及基质分泌情况差别不大，动态组在工程软骨部分有更多的细胞成团状在孔壁伸展，基质分泌更多。