海洋微生物钾转运蛋白基因trkH的克隆与表达

摘要

K+是植物及微生物生长所必需的营养元素之一，广泛分布于有机体内，参与多种重要的生理过程。我国土壤普遍缺钾，并伴有一定程度盐渍化，细胞内过多的Na+积累会产生毒性，因此维持细胞质内相对稳定且较高K+含量和较低Na+含量至关重要。目前从植物中克隆得到的钾吸收相关基因，大部分来自甜土植物，且对应蛋白多数对Na+敏感，使之在高Na+环境下无法较好地行使K+吸收功能。已有研究证实，某些生存在富盐环境的微生物，其K+转运蛋白在高Na+条件下仍有较高K+吸收活性，这些蛋白是一类Trk家族的K+转运蛋白。海洋是高盐环境，海洋微生物中的K+转运蛋白很可能具有这种Na+不敏感性。
　　本研究选用海洋微生物宏基因组DNA为实验材料，该宏基因组DNA包含所收集海水中几乎所有微生物的遗传信息。研究旨在从中获得一种在高盐环境下仍具有钾吸收能力的Na+不敏感钾转运蛋白的基因。本研究克隆得到了钾转运蛋白基因trkH，其完整的ORF长度为1392bp，可编码一个含463个氨基酸的蛋白。生物信息分析结果表明，该蛋白属于TrkH超家族，且具有10个跨膜结构域，是典型的细菌TrkH家族钾离子转运蛋白。同源性比对和系统发育树分析结果表明，TrkH的氨基酸序列和目前已验证功能的TrkH家族蛋白之间仅有22％-36％的同源性，亲缘关系较远。构建酵母表达载体pYES2.0-trkH，并以大肠杆菌的EctrkH作对照，在钾吸收缺陷型酵母CY162中进行功能探究。功能互补和K+耗竭实验结果表明，在外界K+浓度为3mM时，海洋来源TrkH和大肠杆菌EcTrkH在K+吸收功能上并无明显差别;在不同K+/Na+浓度梯度下对转化后酵母的生长情况进行了比较，结果显示TrkH是一个低亲和K+转运蛋白，且初步表明在含有3mM K+和100mM Na+的培养条件下，TrkH比EcTrkH表现出更高的Na+不敏感性。本研究是该类基因首次在真核系统内表达并进行功能探究。为进一步研究其在植物中的功能，构建植物表达载体并采用农杆菌介导的花序浸染法将重组质粒导入拟南芥使，通过Basta筛选和检测获得了T1代转基因植株。

目录

声明

摘要

引言

1 微生物Trk钾吸收系统研究进展

1．1 植物与微生物钾营养概况

1．2 土壤缺钾及盐渍化危害

1．3 微生物Trk钾吸收系统

1．3．1 原核微生物中的Trk系统

1．3．2 真核微生物中的Trk系统

1．3．3 Trk系统研究展望

1．4 宏基因组学发展概况

1．5 研究目的和意义

2 海洋微生物trkH基因的克隆与序列分析

2．1 实验材料与设备

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 实验设备

2．2 实验方法

2．2．1 海洋微生物宏基因组DNA提取

2．2．2 海洋微生物trkH基因保守区的克隆

2．2．3 锚定PCR法克隆trkH基因5’端和3’端

2．2．4 海洋微生物trkH基因ORF的获得

2．2．5 海洋微生物trkH基因生物信息学分析

2．2．6 大肠杆菌Esoherichia coli中EctrkH的克隆

2．3 结果与分析

2．3．1 海洋微生物宏基因组DNA提取

2．3．2 保守区的克隆

2．3．3 锚定PCR法克隆trkH基因5’端和3’端

2．3．4 海洋微生物trkH基因ORF的获得

2．3．5 海洋微生物trkH基因生物信息学分析

2．3．6 大肠杆菌Escharichia coli中EctrkH的克隆

2．4 讨论

2．5 小结

3 酵母表达载体构建、遗传转化及功能分析

3．1 实验材料与设备

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 实验设备

3．2 实验方法

3．2．1 构建pYES2．0-trkH酵母表达载体

3．2．2 构建pYES2．0-EctrkH酵母表达载体

3．2．3 重组质粒的酵母遗传转化

3．2．4 转化酵母的分子检测

3．2．5 转化酵母的功能分析

3．3 结果与分析

3．3．1 构建pYES2．0-trkH酵母表达载体

3．3．2 构建pYES2．0-trkH酵母表达载体

3．3．3 重组质粒的酵母遗传转化

3．2．4 转化酵母的功能分析

3．4 讨论

3．5 小结

4 构建植物表达载体并转化拟南芥

4．1 实验材料及设备

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验试剂

4．1．3 实验设备

4．2 实验方法

4．2．1 trkH基因植物表达载体构建

4．2．2 重组质粒转化农杆菌EHA101

4．2．3 农杆菌转化拟南芥

4．2．4 转基因拟南芥Basra筛选

4．2．5 转基因拟南芥分子检测

4．3 实验结果

4．3．1 trkH基因植物表达载体构建

4．3．2 重组质粒转化农杆菌EHA101

4．3．3 转基因拟南芥Basra筛选

4．3．4 转基因拟南芥分子检测

4．4 讨论

4．5 小结

结论

展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢