Mcl-1蛋白与Mule BH3肽段或BH3模拟分子S1-16的共结晶

摘要

细胞凋亡是细胞的程序性死亡过程，有利于维持生物体的内环境稳态。Bcl-2(B-celllympho ma2)家族蛋白作为线粒体凋亡途径中的调控者，扮演了至关重要的角色。家族中的抗凋亡蛋白与促凋亡蛋白通过保守的BH（Bcl-2 homology）3结构域相互作用决定着细胞的命运。研究发现，当细胞内的抗凋亡蛋白过量表达时，会使细胞逃避凋亡，获得永生，这也是多种肿瘤发生和发展的重要原因之一。因此，以抗凋亡蛋白为靶点，促进其降解或者下调其功能，成为肿瘤治疗的新的策略。
　　Mule(Mcl-1 ubiquitin ligase E3)，是最新发现的BH3-only蛋白。它能够通过保守的BH3结构域特异地结合Bcl-2家族的重要抗凋亡成员之一， Mcl-1(myeloid cellleukaemia1)蛋白，使其泛素化从而被蛋白酶体降解。但是，二者发生相互作用的结构基础尚未解析。S1-16是本课题组设计合成的BH3功能模拟分子，已经通过细胞生物学实验，从功能上证明它能够结合Mcl-1蛋白的活性位点:BH3沟槽，从而抑制其抗凋亡功能。但是，S1-16与Mcl-1蛋白相结合的结构信息尚不充分。
　　本研究以Mcl-1蛋白为对象，以获得Mcl-1蛋白与Mule BH3肽段以及Mcl-1蛋白与S1-16的共结晶晶体为目标，解析晶体结构，从空间结构水平分析它们的作用机制。本研究将为新一代Mcl-1抑制剂类BH3功能模拟分子的设计和优化提供结构依据。
　　首先，对Mcl-1蛋白进行重组表达。使用E.coli表达系统，转入含有目的基因的质粒，经诱导表达及纯化条件的优化，最终获得纯度达到95％以上的Mcl-1蛋白。随后，通过ITC实验和NMR实验，证明了Mcl-1蛋白的活性和空间结构的折叠正常。这些结果表明，表达纯化的Mcl-1蛋白满足结构生物学的研究需要。
　　接下来，对Mcl-1蛋白和Mule BH3肽段进行共结晶实验。基于气相扩散法的原理，采用坐滴法，对结晶条件、试剂进行筛选和优化，获得了满足X-射线衍射要求的晶体，衍射数据达到2.05(A)，解析得到Mcl-1蛋白与Mule BH3肽段复合物的空间结构。经分析发现，Mule BH3肽段上位于α螺旋一个侧面的四个氨基酸残基，插入到Mcl-1蛋白BH3结构域的疏水沟槽中。此外，Mule BH3肽段上一个保守Asp残基与Mcl-1蛋白BH1结构域上的Arg263残基形成盐桥。首次在结构水平上证实了Mule与Mcl-1蛋白的作用机制。
　　之后，尝试获得Mcl-1蛋白与BH3功能模拟分子S1-16的共结晶晶体。在蛋白晶体浸泡法失败后，继续采取坐滴法进行共结晶实验，得到了蛋白晶体，为结晶条件的进一步优化奠定了基础。
　　综上所述，本研究首次得到了Mcl-1蛋白与Mule BH3肽段复合物晶体，并从结构水平分析了二者的作用机制，为设计能够促进Mcl-1蛋白泛素化降解或抑制其功能的BH3模拟子提供了结构依据。此外，还初步筛选到了Mcl-1蛋白与S1-16共结晶的条件，为后续的优化奠定了基础。

目录

声明

摘要

引言

1 综述

1．1 细胞凋亡与Bcl-2家族蛋白

1．1．1 细胞凋亡

1．1．2 Bcl-2家族蛋白

1．1．3 Mcl-1蛋白

1．2 BH3功能模拟分子

1．3 泛素化和Mule

1．4 蛋白质结晶

1．5 本研究的选题依据和研究内容

2 重组Mcl-1蛋白的表达纯化及活性与结构的鉴定

2．1 引言

2．2 实验材料、试剂与仪器

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验仪器

2．2．4 实验溶液的配制

2．3 实验方法

2．3．1 感受态细胞的制备

2．3．2 质粒转化

2．3．3 重组Mcl-1蛋白的诱导表达

2．3．4 重组Mcl-1蛋白的纯化

2．3．5 蛋白质浓度的测定

2．3．6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．3．7 Western Blot

2．3．8 等温滴定量热实验

2．3．9 蛋白质1H-15N HSQC谱图的测定

2．4 实验结果

2．4．1 重组Mcl-1蛋白的诱导表达

2．4．2 重组Mcl-1蛋白的纯化

2．4．3 重组Mcl-1蛋白活性的鉴定

2．4．4 重组Mcl-1蛋白三维结构的鉴定

2．5 讨论

2．6 本章小结

3 Mcl-1与Mule BH3肽段的共结晶

3．1 引言

3．2 实验材料、试剂与仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 Mcl-1与Mule BH3肽段共结晶条件的初筛

3．3．2 Mcl-1与Mule BH3肽段共结晶条件的优化

3．3．3 Mcl-1与Mule BH3肽段复合物晶体衍射数据的收集

3．3．4 Mcl-1与Mule BH3肽段复合物晶体结构的解析

3．4 实验结果

3．4．1 Mcl-1与Mule BH3肽段共结晶条件的初筛

3．4．2 Mcl-1与Mule BH3肽段共结晶条件的优化

3．4．3 晶体X-射线衍射数据的收集和解析

3．4．4 Mcl-1与Mule BH3肽段作用机制的分析

3．5 讨论

3．6 本章小结

4 Mcl-1蛋白与BH3模拟分子S1-16的共结晶

4．1 引言

4．2 实验材料、试剂与仪器

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验试剂

4．2．3 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 蛋白晶体浸泡法

4．3．2 Mcl-1与S1-16共结晶条件的初筛

4．3．3 Mcl-1与S1-16共结晶条件的优化

4．3．4 蛋白晶体染色

4．3．5 Mcl-1与S1-16共结晶晶体衍射测试和数据收集

4．4 实验结果

4．4．1 Mcl-1与S1-16共结晶晶体的获得

4．4．2 蛋白质晶体的X-射线衍射检测

4．5 讨论

4．6 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢